作者tempsperdu (valine)
看板Biotech
标题[求救] RNA pellet的回溶
时间Sat Jun 16 19:11:26 2012
连续三次RNA浓度都过低(0.1 ug/ul以下)，完全无法转DNA
以下是我的操作步骤，请大家看看是否有问题，谢谢
1.细胞数量：12 well，50000 cells/well，长7天 （之前也是这个细胞数，抽得出来）
2.TRIzol 400 ul/well，倾斜刮细胞，在显微镜下确认细胞已被刮除
3.收集至eppendorf，加chloroform 80 ul，混合均匀静置2分钟，12000xg离心15分钟
4.取上清液170 ul，加isopropanol 200 ul，混合均匀静置10分钟，12000xg离心10分钟
5.倒去上清液，看得到pellet，加75% EtOH in DEPC H2O 1 ml，7500 xg离心5分钟
6.倒去上清液，看得到pellet，倒置於laminar flow烘乾，确认pellet在管底没漂走
(自从第一次做RNA extraction发现有有机溶剂污染後，我都烘乾1 h，确保EtOH没残留)
7.看得到管底有一圈，pellet本身变透明，加15 ul DEPC H2O，静置5分钟
8.缓慢pipet 5下，spin down，静置5分钟，取2 ul以Nano Vue测浓度
曾想过是否是pellet太乾无法回溶，虽然之前我也是烘乾1 h，
拿三天前也是浓度太低的RNA做测试（保存在-70度。三天总该回溶了吧？），
结果浓度和三天前差不多T^T
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.200
1F：推 shenhsu:一小时太久了吧 囧 可以用tip吸乾放个10-15分就差不多了 06/16 20:19
2F：→ shenhsu:不然也可以稍微加热一下 应该是乾到溶不掉了... 06/16 20:20
3F：→ ashiniii:应该不太可能乾到溶不掉,有时候忙都放好几天才回溶 06/16 21:12
4F：→ ashiniii:也是OK的 06/16 21:12
5F：→ Ianthegood:RNA乾太久好像会无法回溶耶 06/17 00:28
6F：推 qqmango:加热55-60 10min回溶 06/17 01:31
7F：推 huuban:所以之前有成功过罗？做法上有什麽改变？ 06/17 01:46
8F：推 ckr:加热回溶试试看 06/17 12:32
加热回溶会不会破坏RNA呢? 因为我连vortex都害怕会让它断掉
9F：→ huuban:qqmango:加热55-60 10min回溶，我也都是这麽溶的:) 06/17 15:28
10F：→ huuban:啊不对，我是用65度 xD 06/17 15:28
11F：推 joseph103331:单纯加热跟vortex应该不会断掉啦 06/17 15:47
12F：推 ckr:Trizol的protocol就有55-60度回溶步骤啊 尤其乾一小时应该 06/17 22:13
13F：→ ckr:不好溶 有机溶剂对你後续实验影响大吗? 06/17 22:14
据说Q-PCR machine会自动终止（虽然我没经历过）
14F：→ huuban:不然去借抽气机？通常都蛮快就可以抽乾了喔~ 06/18 11:11
15F：→ huuban:之前回收量最高可以到多少呢? 06/18 11:14
只要有0.1 ug/ul以上就可以转cDNA了，最高有0.2 ug/ul左右吧
16F：→ Realthugz:我记得trizol protocol都有叫你不要晾乾到透明了 06/18 12:45
17F：→ WinnieDad:RNA vortex不太会断，毕竟不像是genomic DNA那种大分子 06/18 23:11
18F：→ puec2:1小时太久 基本上变透明就算是没救了 DNA RNA都一样 06/23 03:03
19F：→ puec2:一点点酒精残留也不会怎样 06/23 03:03
20F：→ puec2:你可以把EtOH倒掉以後 spin 5sec 再用tip把剩下的EtOH吸掉 06/23 03:04
21F：→ puec2:风乾1分钟 06/23 03:04
好，我会试试，谢谢大家
※ 编辑: tempsperdu 来自: 60.251.101.158 (06/23 12:49)
22F：推 ko363630:RNA extraction 没有加热的步骤? 07/09 22:34