作者mkmai0802 (Wengda)
看板Biotech
標題[求救]土法煉鋼做Site-Directed Mutagenesis !
時間Tue Jun 5 14:58:22 2012
教授不給我買kit T.T
只好拿實驗室有的東西來Try Try 看 ~
Polymerase 方面的問題 :
一般的Taq -
會在尾端多加一個A 好像不能用 而且會產生更多突變 !
NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase -
這個可以用嗎 ? 我很怕他會把single-strand primer 切掉 ~
我有上它網站查 只有寫說 會產生 Blunt-ended product !
也俱有3’→ 5’ exonuclease 活性 ! 但沒有寫到會不會把Primer切掉 ~
Pfu Turbo High-Fidelity DNA Polymerase -
想買這個來用 ~ kit 也用這種的 ~ 具有上述的優點 !!
所以想知道 NEB的那株Polymerase能不能拿來用 !!
DpnI方面 - 不一定要用吧 ?? 可能就麻煩多定序幾顆 ? 是這樣嗎 ?
還是大大在做的時候還是會習慣 要加入這個步驟 比較省事 !!??
Competent cell - 實驗室只有DH5alpa
DH5alpa 是否也具有將 nicks 修補的功能 !!
煩請熟練的大大分享一下心得 ~
感謝 !!
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我愛妳 用生命的愛 ~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.73
1F：推 hangzer:Pru?? DapI?? 你要不要把錯字改一改orz 06/05 15:18
※ 編輯: mkmai0802 來自: 203.64.80.73 (06/05 15:27)
2F：→ mkmai0802:哈哈 打錯了 抱歉 ~ 忘了檢查 >< ! 06/05 15:27
3F：→ mkmai0802:阿這位大大可以幫我解答嗎 感謝 XD 06/05 15:28
4F：推 hangzer:基本上我都是用pfu這個polymer做 然後做完一定要用DpnI切 06/05 15:52
5F：→ hangzer:不然保證你做出來都是沒變過去的 DH5alpha就ok了 只是我 06/05 15:53
6F：→ hangzer:是用commercial的 效率會比較高 06/05 15:53
7F：→ hangzer:基本上protocol可以參考QuikChange Site-Directed 06/05 15:55
8F：→ hangzer:Mutagenesis Kit的份去做 成功率滿高的 06/05 15:55
9F：推 nhxcyge:我是下10~50ng的template，然後用互補的primers P一圈 06/05 18:23
10F：→ nhxcyge:plasmid，25個cycles後用DpnI切，切完就照一般的transform 06/05 18:24
11F：→ nhxcyge:步驟做，然後我也是用自己做的DH5a competent cell. 06/05 18:24
12F：→ nhxcyge:p.s. 我是用Fermentas的polymerase和digestion enzyme 06/05 18:25
13F：推 icome:用過pfu和KOD 成功率很高 不過extension時間要久一點 06/05 19:31
14F：→ icome:要比廠商建議的時間多一倍 06/05 19:31
15F：→ icome:我也是用QuikChange protocol 06/05 19:32
16F：推 qumai:pfu跟phusion都可以~ 其實kit也只有polymerase跟DpnI吧XD 06/05 20:15
17F：→ blence:買零件比較划算，實驗室有現成的都可以用，kit指是把method 06/05 20:56
18F：→ blence:會用到的賣給你而已，跟成功最相關的primer也是自己設計的 06/05 20:59
19F：推 aggaci:根本不需要kit阿...你只需要厲害的pfu跟磷酸化的primer 06/06 04:46
20F：推 lyu0001:Phusion很貴耶 查一查舊文就知道怎麼做的 06/06 17:10
21F：推 lyu0001:先想好primer怎麼設計吧 06/06 17:30
22F：推 HOPEFIRE:quick change買pfu跟DpnI就好啦 買kit很浪費吧 06/09 14:24
23F：→ HOPEFIRE:dh5a就夠用了 06/09 14:24
24F：推 Nicoleching:1. 我以前就是用phusion在做site directed 06/19 22:41
25F：→ Nicoleching:2. 買 DpnI + Primer設計的溫度參考 invitrogen kit的 06/19 22:42
26F：→ Nicoleching:protocol (網站應該可以download吧!!) 就可以很順利 06/19 22:42
27F：推 Nicoleching:以前買一組kit好像是兩萬多吧...(學姊買的不是我..) 06/19 22:44