作者mkmai0802 (Wengda)
看板Biotech
标题[求救]土法炼钢做Site-Directed Mutagenesis !
时间Tue Jun 5 14:58:22 2012
教授不给我买kit T.T
只好拿实验室有的东西来Try Try 看 ~
Polymerase 方面的问题 :
一般的Taq -
会在尾端多加一个A 好像不能用 而且会产生更多突变 !
NEB Phusion High-Fidelity DNA Polymerase -
这个可以用吗 ? 我很怕他会把single-strand primer 切掉 ~
我有上它网站查 只有写说 会产生 Blunt-ended product !
也俱有3’→ 5’ exonuclease 活性 ! 但没有写到会不会把Primer切掉 ~
Pfu Turbo High-Fidelity DNA Polymerase -
想买这个来用 ~ kit 也用这种的 ~ 具有上述的优点 !!
所以想知道 NEB的那株Polymerase能不能拿来用 !!
DpnI方面 - 不一定要用吧 ?? 可能就麻烦多定序几颗 ? 是这样吗 ?
还是大大在做的时候还是会习惯 要加入这个步骤 比较省事 !!??
Competent cell - 实验室只有DH5alpa
DH5alpa 是否也具有将 nicks 修补的功能 !!
烦请熟练的大大分享一下心得 ~
感谢 !!
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我爱你 用生命的爱 ~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.73
1F：推 hangzer:Pru?? DapI?? 你要不要把错字改一改orz 06/05 15:18
※ 编辑: mkmai0802 来自: 203.64.80.73 (06/05 15:27)
2F：→ mkmai0802:哈哈 打错了 抱歉 ~ 忘了检查 >< ! 06/05 15:27
3F：→ mkmai0802:阿这位大大可以帮我解答吗 感谢 XD 06/05 15:28
4F：推 hangzer:基本上我都是用pfu这个polymer做 然後做完一定要用DpnI切 06/05 15:52
5F：→ hangzer:不然保证你做出来都是没变过去的 DH5alpha就ok了 只是我 06/05 15:53
6F：→ hangzer:是用commercial的 效率会比较高 06/05 15:53
7F：→ hangzer:基本上protocol可以参考QuikChange Site-Directed 06/05 15:55
8F：→ hangzer:Mutagenesis Kit的份去做 成功率满高的 06/05 15:55
9F：推 nhxcyge:我是下10~50ng的template，然後用互补的primers P一圈 06/05 18:23
10F：→ nhxcyge:plasmid，25个cycles後用DpnI切，切完就照一般的transform 06/05 18:24
11F：→ nhxcyge:步骤做，然後我也是用自己做的DH5a competent cell. 06/05 18:24
12F：→ nhxcyge:p.s. 我是用Fermentas的polymerase和digestion enzyme 06/05 18:25
13F：推 icome:用过pfu和KOD 成功率很高 不过extension时间要久一点 06/05 19:31
14F：→ icome:要比厂商建议的时间多一倍 06/05 19:31
15F：→ icome:我也是用QuikChange protocol 06/05 19:32
16F：推 qumai:pfu跟phusion都可以~ 其实kit也只有polymerase跟DpnI吧XD 06/05 20:15
17F：→ blence:买零件比较划算，实验室有现成的都可以用，kit指是把method 06/05 20:56
18F：→ blence:会用到的卖给你而已，跟成功最相关的primer也是自己设计的 06/05 20:59
19F：推 aggaci:根本不需要kit阿...你只需要厉害的pfu跟磷酸化的primer 06/06 04:46
20F：推 lyu0001:Phusion很贵耶 查一查旧文就知道怎麽做的 06/06 17:10
21F：推 lyu0001:先想好primer怎麽设计吧 06/06 17:30
22F：推 HOPEFIRE:quick change买pfu跟DpnI就好啦 买kit很浪费吧 06/09 14:24
23F：→ HOPEFIRE:dh5a就够用了 06/09 14:24
24F：推 Nicoleching:1. 我以前就是用phusion在做site directed 06/19 22:41
25F：→ Nicoleching:2. 买 DpnI + Primer设计的温度参考 invitrogen kit的 06/19 22:42
26F：→ Nicoleching:protocol (网站应该可以download吧!!) 就可以很顺利 06/19 22:42
27F：推 Nicoleching:以前买一组kit好像是两万多吧...(学姊买的不是我..) 06/19 22:44