作者Ritoo (。)
看板Biotech
標題[求救] RT-PCR從有band到smear
時間Mon Jun 4 16:02:34 2012
最近一直陷入reverse-transcriptase無限P不出來的地獄中，
故想請教有無版友有相關經驗或可能的解決方法。
目前的狀況是，我在測試樣品中的ㄧ個target mRNA表現，
其cDNA大約331 bp，
在測試兩、三種primer後決定了其中一個專一性還不錯的primer，
其為22-mer，GC content為52%，annealing溫度為60度C，
一開始有順利P到我預期想看的產物，
但就在上個月初開始，
產物呈現整個smear的狀況，
但同時間，
ladder marker正常，所以我配置的膠片應該ok (2% agarose gel)，
internal control (G3DPH)的表現也ok，所以cDNA樣品理論上應該也ok，
但預期的target mRNA產物就是完全不見了！！！！！
我目前嘗試過的辦法有：
1) 重新訂製新的primer (序列相同)(試過兩次)
2) 使用新鮮配置的水 (四次水)
3) 換不同台PCR機器進行PCR循環
4) 換訂不同廠商的相同序列primer (試過碩禾和百力)
5) 加1%DMSO下去進行PCR循環
6) 使用不同批抽的RNA轉cDNA樣品進行PCR循環
但結果全都失敗了！
而且每次做的結果都類似，
就是IC和ladder marker很清楚，但想看的產物整個smear，
大致如此圖所示：
http://images.plurk.com/56af144622737aad9f3e922b35175b85.jpg
(左半lane 2-6為IC，右半lane 8-12為預期target mRNA產物)
目前呈現有點走投無路的狀態，
誠摯請教各位版友對此有無任何想法，
非常感謝！
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.4.189
1F：→ yaprint:template太多或是MgCl2濃度太高? 06/04 16:14
2F：→ Ritoo:我template的濃度10 ng/ul，PCR是使用EconoTaq kit，裡面的 06/04 16:26
3F：→ Ritoo:MgCl2是3 mM 06/04 16:27
4F：→ Ritoo:所以是可以試試看調整MgCl2的濃度嗎 06/04 16:27
5F：→ huuban:RNA狀況確定OK嗎？ 06/04 17:24
6F：→ Ritoo:有用nanodrop重測過其一樣品，濃度達一千多ng/ul 06/04 18:24
7F：→ Ritoo:260/280約1.8，260/230約2.2 06/04 18:24
8F：→ Ritoo:測的樣品都已經轉成cDNA了 06/04 18:25
9F：推 satantaco:sample是否是馬上抽完就作還是冰凍後解凍再作? 06/04 18:44
10F：→ satantaco:從你的敘述中 上個月都有 這個月開始不行 會懷疑 06/04 18:45
11F：→ satantaco:是否是斷掉了 或者被RNase吃掉了 建議重抽馬上作 06/04 18:46
12F：→ satantaco:如果重抽就做出來了 建議在sample裡加入RNase inhibitor 06/04 18:46
13F：→ Ritoo:我在處理細胞的習慣上，都是當天早上抽RNA，下午轉cDNA和跑 06/04 18:55
14F：→ Ritoo:膠，如果已經轉成cDNA也是有斷掉的可能性嗎？ 06/04 18:56
15F：→ Ritoo:另外，我也有擔心cDNA反覆解凍的問題所以在第6點有以另批轉 06/04 18:56
16F：→ Ritoo:的cDNA進行測試，不過結果一樣是smear 06/04 18:57
17F：→ Ritoo:上述的跑膠是跑RNA膠片確認品質，轉cDNA與PCR膠片則後續進行 06/04 18:58
18F：推 icome:GAPDH很清楚的話表示sample沒問題才對 06/04 22:15
19F：→ icome:這樣子像是沒P到 可能沒表現 或是cycle數不夠 06/04 22:17
20F：→ huuban:的確有聽過RNA影響到cDNA不耐放的案例 06/04 23:07
21F：推 satantaco:這麼說好了 control組都有作出來 所以應該不是試劑類出 06/04 23:08
22F：→ satantaco:狀況 然後primer出問題機率應該不大 因為你之前也批出 06/04 23:09
23F：→ satantaco:來了 cycle數可能增加一點再試試看 06/04 23:10
24F：→ satantaco:以前我遇過類似的問題 最後都是出在sample出狀況 06/04 23:11
25F：→ satantaco:通常放進clone裡的序列 你經由plasmid抽取出來的 06/04 23:12
26F：→ satantaco:因為經過一些wash的extract過程 所以把鹽類還有有的沒 06/04 23:13
27F：→ satantaco:的除掉了 所以會比較穩定 如果是RT產物 或者PCR產物 06/04 23:14
28F：→ satantaco:會比較多變化 06/04 23:15
29F：→ Ritoo:我是直接抽取細胞的RNA，此target mRNA目前的cycle數是40 06/04 23:29
30F：→ Ritoo:我明天試試看提高cycle數，感謝各位！ 06/04 23:29
※ 編輯: Ritoo 來自: 111.249.202.61 (06/04 23:33)
31F：推 joseph103331:你的lane8有P出來不是嗎...? cDNA轉完不要放太久 06/05 00:32
32F：→ joseph103331:單股沒雙股那麼穩定 存不久 看起來是cycle不夠 06/05 00:33
33F：→ joseph103331:可以試試看提高template與cycle數? 06/05 00:35