作者Ritoo (。)
看板Biotech
标题[求救] RT-PCR从有band到smear
时间Mon Jun 4 16:02:34 2012
最近一直陷入reverse-transcriptase无限P不出来的地狱中，
故想请教有无版友有相关经验或可能的解决方法。
目前的状况是，我在测试样品中的ㄧ个target mRNA表现，
其cDNA大约331 bp，
在测试两、三种primer後决定了其中一个专一性还不错的primer，
其为22-mer，GC content为52%，annealing温度为60度C，
一开始有顺利P到我预期想看的产物，
但就在上个月初开始，
产物呈现整个smear的状况，
但同时间，
ladder marker正常，所以我配置的胶片应该ok (2% agarose gel)，
internal control (G3DPH)的表现也ok，所以cDNA样品理论上应该也ok，
但预期的target mRNA产物就是完全不见了！！！！！
我目前尝试过的办法有：
1) 重新订制新的primer (序列相同)(试过两次)
2) 使用新鲜配置的水 (四次水)
3) 换不同台PCR机器进行PCR循环
4) 换订不同厂商的相同序列primer (试过硕禾和百力)
5) 加1%DMSO下去进行PCR循环
6) 使用不同批抽的RNA转cDNA样品进行PCR循环
但结果全都失败了！
而且每次做的结果都类似，
就是IC和ladder marker很清楚，但想看的产物整个smear，
大致如此图所示：
http://images.plurk.com/56af144622737aad9f3e922b35175b85.jpg
(左半lane 2-6为IC，右半lane 8-12为预期target mRNA产物)
目前呈现有点走投无路的状态，
诚挚请教各位版友对此有无任何想法，
非常感谢！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.4.189
1F：→ yaprint:template太多或是MgCl2浓度太高? 06/04 16:14
2F：→ Ritoo:我template的浓度10 ng/ul，PCR是使用EconoTaq kit，里面的 06/04 16:26
3F：→ Ritoo:MgCl2是3 mM 06/04 16:27
4F：→ Ritoo:所以是可以试试看调整MgCl2的浓度吗 06/04 16:27
5F：→ huuban:RNA状况确定OK吗？ 06/04 17:24
6F：→ Ritoo:有用nanodrop重测过其一样品，浓度达一千多ng/ul 06/04 18:24
7F：→ Ritoo:260/280约1.8，260/230约2.2 06/04 18:24
8F：→ Ritoo:测的样品都已经转成cDNA了 06/04 18:25
9F：推 satantaco:sample是否是马上抽完就作还是冰冻後解冻再作? 06/04 18:44
10F：→ satantaco:从你的叙述中 上个月都有 这个月开始不行 会怀疑 06/04 18:45
11F：→ satantaco:是否是断掉了 或者被RNase吃掉了 建议重抽马上作 06/04 18:46
12F：→ satantaco:如果重抽就做出来了 建议在sample里加入RNase inhibitor 06/04 18:46
13F：→ Ritoo:我在处理细胞的习惯上，都是当天早上抽RNA，下午转cDNA和跑 06/04 18:55
14F：→ Ritoo:胶，如果已经转成cDNA也是有断掉的可能性吗？ 06/04 18:56
15F：→ Ritoo:另外，我也有担心cDNA反覆解冻的问题所以在第6点有以另批转 06/04 18:56
16F：→ Ritoo:的cDNA进行测试，不过结果一样是smear 06/04 18:57
17F：→ Ritoo:上述的跑胶是跑RNA胶片确认品质，转cDNA与PCR胶片则後续进行 06/04 18:58
18F：推 icome:GAPDH很清楚的话表示sample没问题才对 06/04 22:15
19F：→ icome:这样子像是没P到 可能没表现 或是cycle数不够 06/04 22:17
20F：→ huuban:的确有听过RNA影响到cDNA不耐放的案例 06/04 23:07
21F：推 satantaco:这麽说好了 control组都有作出来 所以应该不是试剂类出 06/04 23:08
22F：→ satantaco:状况 然後primer出问题机率应该不大 因为你之前也批出 06/04 23:09
23F：→ satantaco:来了 cycle数可能增加一点再试试看 06/04 23:10
24F：→ satantaco:以前我遇过类似的问题 最後都是出在sample出状况 06/04 23:11
25F：→ satantaco:通常放进clone里的序列 你经由plasmid抽取出来的 06/04 23:12
26F：→ satantaco:因为经过一些wash的extract过程 所以把盐类还有有的没 06/04 23:13
27F：→ satantaco:的除掉了 所以会比较稳定 如果是RT产物 或者PCR产物 06/04 23:14
28F：→ satantaco:会比较多变化 06/04 23:15
29F：→ Ritoo:我是直接抽取细胞的RNA，此target mRNA目前的cycle数是40 06/04 23:29
30F：→ Ritoo:我明天试试看提高cycle数，感谢各位！ 06/04 23:29
※ 编辑: Ritoo 来自: 111.249.202.61 (06/04 23:33)
31F：推 joseph103331:你的lane8有P出来不是吗...? cDNA转完不要放太久 06/05 00:32
32F：→ joseph103331:单股没双股那麽稳定 存不久 看起来是cycle不够 06/05 00:33
33F：→ joseph103331:可以试试看提高template与cycle数? 06/05 00:35