作者firstfrost (阿水)
看板Biotech
標題[求救] RT-PCR出不來
時間Tue May 29 11:20:00 2012
請問板上各位強者
因為小弟現在開始碰到要抽取大鼠spinal cord組織mRNA的實驗
使用的是Q牌的kit(好貴...)
但是抽出來的RNA濃度大約只有100~200ng/ul(好少...)
而且在做RT-PCR的結果中
不論哪次抽的組織
TNF-a(40cycle) IL-1b(35cycle) GAPDH(25cycle)都可以順利P出來
但是IL-6卻是只有第一次抽的組織P的出來(primer沒問題)
之後抽的組織跑出來都空空如也(但是TNF-a IL-1b GAPDH都正常)
而且IL-6都發神經跑到60cycle...還是空的
實驗步驟如下:
組織取下來放到RNA later保存4度C overnight
隔天取出來放入RLT buffer中以Microson的sonicator打破組織至無塊狀
之後離心並加入70%EtOH
再來就是讓RNA binding在Kit附的膜上進行一連串的wash
最後用50ul RNase free water elute
RT轉1.5ugRNA
PCR時取4.5ul的RT sample(總體積50ul)
以上全部都大手筆買Q牌的kit...
但還是卡在IL-6無法正常P出來的狀況
如果RNA被震斷裂 那GAPDH還跑得出來...?
但是通常作一組實驗(無加藥老鼠組 加藥老鼠組 無加藥治療老鼠組 加藥+治療老鼠組)
共4個spinal cord sample卻會出現只有某一組IL-6可以PCR出來，其他組都不行...
但是mRNA都是同時抽 同時轉RT 同時PCR...
感謝各位看完這麼冗長的實驗經過 也請給些意見 感謝!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.10
1F：推 puec2:pipetman污染 拆開來清洗+滅菌以後應該會全都p不出來 05/29 14:31
2F：推 jabari:control的功能就是告訴你rna is fine.. primer換過吧 05/29 15:03
3F：推 satantaco:有一種東西叫filter tip~~然後勒 某些品牌會告訴你 05/31 22:24
4F：→ satantaco:filter的作用是保護你的pipet不會爆衝 但是正確的品牌 05/31 22:26
5F：→ satantaco:會告訴你 filter的意義在於防止上下端gas層的交互汙染 05/31 22:26
6F：→ satantaco:所以 選用正確的filter tip可以避免你的pipet汙染問題 05/31 22:28
7F：→ satantaco:另外某些pipet會告訴你整支可以拿去菌 請不要再相信拔 05/31 22:29
8F：→ satantaco:獅子鬆毛可以...的傳說了 pipet上端的機心不能拿去滅菌 05/31 22:29
9F：→ satantaco:原因在於 機心內有機械的連機點 還有螺絲等各種構造 05/31 22:30
10F：→ satantaco:在高壓高溫下 每個部見的膨脹系數都會不同 然後冷卻 05/31 22:31
11F：→ satantaco:時冷縮的係數也有差 因此整支拿去滅只會讓你的pipet提 05/31 22:31
12F：→ satantaco:前壽終正寢 除機心之外的部分則是可以拆下後滅菌的 05/31 22:32