作者firstfrost (阿水)
看板Biotech
标题[求救] RT-PCR出不来
时间Tue May 29 11:20:00 2012
请问板上各位强者
因为小弟现在开始碰到要抽取大鼠spinal cord组织mRNA的实验
使用的是Q牌的kit(好贵...)
但是抽出来的RNA浓度大约只有100~200ng/ul(好少...)
而且在做RT-PCR的结果中
不论哪次抽的组织
TNF-a(40cycle) IL-1b(35cycle) GAPDH(25cycle)都可以顺利P出来
但是IL-6却是只有第一次抽的组织P的出来(primer没问题)
之後抽的组织跑出来都空空如也(但是TNF-a IL-1b GAPDH都正常)
而且IL-6都发神经跑到60cycle...还是空的
实验步骤如下:
组织取下来放到RNA later保存4度C overnight
隔天取出来放入RLT buffer中以Microson的sonicator打破组织至无块状
之後离心并加入70%EtOH
再来就是让RNA binding在Kit附的膜上进行一连串的wash
最後用50ul RNase free water elute
RT转1.5ugRNA
PCR时取4.5ul的RT sample(总体积50ul)
以上全部都大手笔买Q牌的kit...
但还是卡在IL-6无法正常P出来的状况
如果RNA被震断裂 那GAPDH还跑得出来...?
但是通常作一组实验(无加药老鼠组 加药老鼠组 无加药治疗老鼠组 加药+治疗老鼠组)
共4个spinal cord sample却会出现只有某一组IL-6可以PCR出来，其他组都不行...
但是mRNA都是同时抽 同时转RT 同时PCR...
感谢各位看完这麽冗长的实验经过 也请给些意见 感谢!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.10
1F：推 puec2:pipetman污染 拆开来清洗+灭菌以後应该会全都p不出来 05/29 14:31
2F：推 jabari:control的功能就是告诉你rna is fine.. primer换过吧 05/29 15:03
3F：推 satantaco:有一种东西叫filter tip~~然後勒 某些品牌会告诉你 05/31 22:24
4F：→ satantaco:filter的作用是保护你的pipet不会爆冲 但是正确的品牌 05/31 22:26
5F：→ satantaco:会告诉你 filter的意义在於防止上下端gas层的交互污染 05/31 22:26
6F：→ satantaco:所以 选用正确的filter tip可以避免你的pipet污染问题 05/31 22:28
7F：→ satantaco:另外某些pipet会告诉你整支可以拿去菌 请不要再相信拔 05/31 22:29
8F：→ satantaco:狮子松毛可以...的传说了 pipet上端的机心不能拿去灭菌 05/31 22:29
9F：→ satantaco:原因在於 机心内有机械的连机点 还有螺丝等各种构造 05/31 22:30
10F：→ satantaco:在高压高温下 每个部见的膨胀系数都会不同 然後冷却 05/31 22:31
11F：→ satantaco:时冷缩的系数也有差 因此整支拿去灭只会让你的pipet提 05/31 22:31
12F：→ satantaco:前寿终正寝 除机心之外的部分则是可以拆下後灭菌的 05/31 22:32