作者nzj (edger)
看板Biotech
標題[討論] sonication會破壞細胞核嗎?
時間Sat May 26 21:38:29 2012
大家好:
目前在抽293T細胞的蛋白質,要將其分為核蛋白,細胞質蛋白及膜蛋白
我是將細胞懸在浮低張溶液並以dounce homogenizer將細胞打破,
然後低速離心.不過有個問題就是細胞無法破的很完全,因此低速離心後
會和細胞核一起沉澱.所以我想用sonication的方式讓plasma membrane
破裂,但不確定對細胞核有無影響.
我的想法是plasma membrane既然都能被sonication破壞, 細胞核應該
也會受到破壞. 希望聽聽各位的意見
麻煩了 謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.120.132.179
1F：→ jabari:我一直以為sonication的重點是震斷黏黏的DNA.. 05/26 22:36
2F：→ jabari:要分各區的蛋白, 可以試Thermo的 NE-PER那系列的 05/26 22:39
3F：→ Ianthegood:不能用detergent嗎? 05/26 22:56
4F：→ Ianthegood:sonicator大多可以調強度, 強一點絕對可以打破核膜 05/26 22:57
5F：推 tsubasawolfy:不用這樣硬幹吧ˊ_>ˋ 用NP-40就好了 05/26 23:03
6F：推 joseph103331:sonication完才看得到核蛋白.... 05/26 23:05
7F：→ joseph103331:破細胞來講 通常sonication就是拿來破核啦 05/26 23:05
8F：→ tsubasawolfy:你去下載NE-PER的protocol 裡面CERI用你的hypotonic 05/26 23:06
9F：→ tsubasawolfy:CERII用10% NP-40 NER用high salt buffer 照他流程 05/26 23:07
10F：→ tsubasawolfy:走就可以拿到小體積的分離(I+II完後洗一下pellet可以 05/26 23:08
11F：→ tsubasawolfy:降低NE pellet中cyto的殘餘量, 洗完換到新管可以更 05/26 23:09
12F：→ tsubasawolfy:乾淨) 不建議用sonication是因為拿到核通常是像鼻涕 05/26 23:10
13F：→ tsubasawolfy:一樣黏成一團 超音波對這種分不開的效率不好ˊ_>ˋ 05/26 23:11
14F：→ nzj:謝謝各位,不過我可能沒有表達很好,其實我的重點是要破plasma 05/27 08:13
15F：→ nzj:membrane,而不希望把細胞核打破,所以想問說哪種方法可以 05/27 08:14
16F：→ nzj:完全的將細胞打破,卻又不會破壞核膜....謝謝各位 05/27 08:15
17F：推 tsubasawolfy:原來我打的是外星文一.一 05/27 08:38
18F：→ nzj:哈囉 我有上網看了一下NE-PER的nuclear及cytoplasmic protocol 05/27 09:52
19F：→ nzj:如果CERII是10% NP40(detergent),那麼再這一步核膜就已經破掉 05/27 09:53
20F：→ nzj:這個時候再去離心核蛋白還是留在supernatant,並沒有分離效果 05/27 09:55
21F：→ nzj:所以我想問的是你是不是把CERII和NER兩個搞反了 05/27 09:57
22F：→ nzj:無論如何 還是謝謝你的回答 05/27 09:57
23F：推 tsubasawolfy:NP40是破細胞膜的....照他體積下去稀釋最終濃度0.1％ 05/27 10:13
24F：→ tsubasawolfy:直接加10%當然會破... 05/27 10:13
26F：→ tsubasawolfy:step3-8完全都是收cyto部分 step9-12才是NE 05/27 10:17
27F：→ nzj:哈囉 我們看的是同一個protocol沒錯 05/27 10:31
28F：→ nzj:不過11ul,10%的NP40加到210ul CERI,最後的濃度是0.52 % 05/27 10:34
29F：→ nzj:如果照你的推論加NP40不會破的話,那加NER(high salt burrer) 05/27 10:43
30F：→ nzj:就更不會破了,也就是照這個protocol走下去,最後凍在-80freezer 05/27 10:44
31F：→ nzj:會是沒有破掉的核 05/27 10:44
32F：→ nzj:另外CERI如果是hypotonic buffer是合理的,因為細胞膜會破 05/27 10:59
33F：→ nzj:就是靠著低張容液將細胞膜撐破,而細胞核有核孔,所以就不會破掉 05/27 11:00
34F：→ nzj:一般的protocol都是加完低張溶液,然後1000g離心將核沉澱 05/27 11:01
35F：→ nzj:一般很少會在離心之前加detergent因為濃度低還是可能會破核 05/27 11:04
36F：→ nzj:我個人覺得如果CERII是high salt buffer,NER若是NP40 05/27 11:07
37F：→ nzj:那最後凍在-80 freezer會是核蛋白,而不會只是沒有破掉的核 05/27 11:08
38F：→ nzj:最後還是謝謝你提供這個方法,看起來很棒 05/27 11:09
39F：推 tsubasawolfy:NER使用是高鹽份溶液抽出核蛋白 並不是打破核膜方式 05/27 11:36
40F：→ tsubasawolfy:高鹽抽出核蛋白原理Google一下就有 另外核膜有蛋白質 05/27 11:38
41F：→ tsubasawolfy:包覆所以NP40並不會破壞核膜 使用detergent方式破壞 05/27 11:39
42F：→ tsubasawolfy:細胞膜是因為低張溶液只是讓細胞膜稱大到一個極限 05/27 11:40
43F：→ tsubasawolfy:要真正破壞就要破壞CHOLESTEROL對細胞膜的穩定性 05/27 11:41
44F：→ tsubasawolfy:所以才用detergent插入細胞膜達成破壞穩定性效果 05/27 11:41
45F：→ tsubasawolfy:不使用detergent就用物理性破壞例如針頭的高低壓差 05/27 11:42
46F：→ tsubasawolfy:還有dounce下去作物理性破壞才可以lysis完全 05/27 11:43
47F：→ tsubasawolfy:BTW NP40的上限是1％ and我很確定CERII是NP40 05/27 11:45
48F：→ nzj:一般高鹽抽出核蛋白的方式都是在已經打破核膜的情況下 05/28 07:46
49F：→ nzj:在高鹽的情況下,DNA會沉澱,蛋白質會溶在上清液,藉此分離 05/28 07:50
50F：→ nzj:所以有沒有另一種可能,就是加CERII(NP40)後,核膜破掉了 05/28 07:51
51F：→ nzj:但lamin還維持核的結構(membrane包覆著lamin) 05/28 07:52
52F：→ nzj:最後離心後藉高鹽將DNA及proteins分開. 05/28 07:53
53F：推 tsubasawolfy:要不要乾脆我附DATA算了?一翻兩瞪眼? 05/28 09:25
54F：推 jabari:樓上呀..你已經給他魚竿了..他想吃魚就得自己釣囉 @w@a 05/28 12:25
55F：→ nzj:不過討論嘛,不需要這麼激動,感謝 05/28 22:33
56F：→ nzj:我說的另一種可能,就是你講的那樣,CERII是NP40,NER是高鹽溶液 05/28 22:55
57F：→ nzj:我純粹對原理感興趣罷了.... 05/28 22:56
58F：→ nzj:順帶一提,發表在Science signaling的一篇 05/28 22:59
59F：→ nzj:DOI: 10.1126/scisignal.2002373,裡面提到這個kit 05/28 22:59
60F：→ nzj:NE-PER,在核的部份其實會雜到membane protein的markers 05/28 23:01
61F：→ nzj:上面沒有講清楚,是plasma membrane proteins 05/28 23:05
62F：→ Lccw:其實市面上的kit多少都還是會分不乾淨的...... 05/29 01:54
63F：→ Lccw:T大其實已經說的很清楚~連原理都附給你了~真的= = 05/29 01:54
64F：→ nzj:我從頭到尾都很感謝有人願意回答這個問題 謝謝 05/29 08:45
65F：→ nzj:這個討論串其實讓我學到不少 05/29 09:00