作者nzj (edger)
看板Biotech
标题[讨论] sonication会破坏细胞核吗?
时间Sat May 26 21:38:29 2012
大家好:
目前在抽293T细胞的蛋白质,要将其分为核蛋白,细胞质蛋白及膜蛋白
我是将细胞悬在浮低张溶液并以dounce homogenizer将细胞打破,
然後低速离心.不过有个问题就是细胞无法破的很完全,因此低速离心後
会和细胞核一起沉淀.所以我想用sonication的方式让plasma membrane
破裂,但不确定对细胞核有无影响.
我的想法是plasma membrane既然都能被sonication破坏, 细胞核应该
也会受到破坏. 希望听听各位的意见
麻烦了 谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 122.120.132.179
1F：→ jabari:我一直以为sonication的重点是震断黏黏的DNA.. 05/26 22:36
2F：→ jabari:要分各区的蛋白, 可以试Thermo的 NE-PER那系列的 05/26 22:39
3F：→ Ianthegood:不能用detergent吗? 05/26 22:56
4F：→ Ianthegood:sonicator大多可以调强度, 强一点绝对可以打破核膜 05/26 22:57
5F：推 tsubasawolfy:不用这样硬干吧ˊ_>ˋ 用NP-40就好了 05/26 23:03
6F：推 joseph103331:sonication完才看得到核蛋白.... 05/26 23:05
7F：→ joseph103331:破细胞来讲 通常sonication就是拿来破核啦 05/26 23:05
8F：→ tsubasawolfy:你去下载NE-PER的protocol 里面CERI用你的hypotonic 05/26 23:06
9F：→ tsubasawolfy:CERII用10% NP-40 NER用high salt buffer 照他流程 05/26 23:07
10F：→ tsubasawolfy:走就可以拿到小体积的分离(I+II完後洗一下pellet可以 05/26 23:08
11F：→ tsubasawolfy:降低NE pellet中cyto的残余量, 洗完换到新管可以更 05/26 23:09
12F：→ tsubasawolfy:乾净) 不建议用sonication是因为拿到核通常是像鼻涕 05/26 23:10
13F：→ tsubasawolfy:一样黏成一团 超音波对这种分不开的效率不好ˊ_>ˋ 05/26 23:11
14F：→ nzj:谢谢各位,不过我可能没有表达很好,其实我的重点是要破plasma 05/27 08:13
15F：→ nzj:membrane,而不希望把细胞核打破,所以想问说哪种方法可以 05/27 08:14
16F：→ nzj:完全的将细胞打破,却又不会破坏核膜....谢谢各位 05/27 08:15
17F：推 tsubasawolfy:原来我打的是外星文一.一 05/27 08:38
18F：→ nzj:哈罗 我有上网看了一下NE-PER的nuclear及cytoplasmic protocol 05/27 09:52
19F：→ nzj:如果CERII是10% NP40(detergent),那麽再这一步核膜就已经破掉 05/27 09:53
20F：→ nzj:这个时候再去离心核蛋白还是留在supernatant,并没有分离效果 05/27 09:55
21F：→ nzj:所以我想问的是你是不是把CERII和NER两个搞反了 05/27 09:57
22F：→ nzj:无论如何 还是谢谢你的回答 05/27 09:57
23F：推 tsubasawolfy:NP40是破细胞膜的....照他体积下去稀释最终浓度0.1％ 05/27 10:13
24F：→ tsubasawolfy:直接加10%当然会破... 05/27 10:13
26F：→ tsubasawolfy:step3-8完全都是收cyto部分 step9-12才是NE 05/27 10:17
27F：→ nzj:哈罗 我们看的是同一个protocol没错 05/27 10:31
28F：→ nzj:不过11ul,10%的NP40加到210ul CERI,最後的浓度是0.52 % 05/27 10:34
29F：→ nzj:如果照你的推论加NP40不会破的话,那加NER(high salt burrer) 05/27 10:43
30F：→ nzj:就更不会破了,也就是照这个protocol走下去,最後冻在-80freezer 05/27 10:44
31F：→ nzj:会是没有破掉的核 05/27 10:44
32F：→ nzj:另外CERI如果是hypotonic buffer是合理的,因为细胞膜会破 05/27 10:59
33F：→ nzj:就是靠着低张容液将细胞膜撑破,而细胞核有核孔,所以就不会破掉 05/27 11:00
34F：→ nzj:一般的protocol都是加完低张溶液,然後1000g离心将核沉淀 05/27 11:01
35F：→ nzj:一般很少会在离心之前加detergent因为浓度低还是可能会破核 05/27 11:04
36F：→ nzj:我个人觉得如果CERII是high salt buffer,NER若是NP40 05/27 11:07
37F：→ nzj:那最後冻在-80 freezer会是核蛋白,而不会只是没有破掉的核 05/27 11:08
38F：→ nzj:最後还是谢谢你提供这个方法,看起来很棒 05/27 11:09
39F：推 tsubasawolfy:NER使用是高盐份溶液抽出核蛋白 并不是打破核膜方式 05/27 11:36
40F：→ tsubasawolfy:高盐抽出核蛋白原理Google一下就有 另外核膜有蛋白质 05/27 11:38
41F：→ tsubasawolfy:包覆所以NP40并不会破坏核膜 使用detergent方式破坏 05/27 11:39
42F：→ tsubasawolfy:细胞膜是因为低张溶液只是让细胞膜称大到一个极限 05/27 11:40
43F：→ tsubasawolfy:要真正破坏就要破坏CHOLESTEROL对细胞膜的稳定性 05/27 11:41
44F：→ tsubasawolfy:所以才用detergent插入细胞膜达成破坏稳定性效果 05/27 11:41
45F：→ tsubasawolfy:不使用detergent就用物理性破坏例如针头的高低压差 05/27 11:42
46F：→ tsubasawolfy:还有dounce下去作物理性破坏才可以lysis完全 05/27 11:43
47F：→ tsubasawolfy:BTW NP40的上限是1％ and我很确定CERII是NP40 05/27 11:45
48F：→ nzj:一般高盐抽出核蛋白的方式都是在已经打破核膜的情况下 05/28 07:46
49F：→ nzj:在高盐的情况下,DNA会沉淀,蛋白质会溶在上清液,藉此分离 05/28 07:50
50F：→ nzj:所以有没有另一种可能,就是加CERII(NP40)後,核膜破掉了 05/28 07:51
51F：→ nzj:但lamin还维持核的结构(membrane包覆着lamin) 05/28 07:52
52F：→ nzj:最後离心後藉高盐将DNA及proteins分开. 05/28 07:53
53F：推 tsubasawolfy:要不要乾脆我附DATA算了?一翻两瞪眼? 05/28 09:25
54F：推 jabari:楼上呀..你已经给他鱼竿了..他想吃鱼就得自己钓罗 @w@a 05/28 12:25
55F：→ nzj:不过讨论嘛,不需要这麽激动,感谢 05/28 22:33
56F：→ nzj:我说的另一种可能,就是你讲的那样,CERII是NP40,NER是高盐溶液 05/28 22:55
57F：→ nzj:我纯粹对原理感兴趣罢了.... 05/28 22:56
58F：→ nzj:顺带一提,发表在Science signaling的一篇 05/28 22:59
59F：→ nzj:DOI: 10.1126/scisignal.2002373,里面提到这个kit 05/28 22:59
60F：→ nzj:NE-PER,在核的部份其实会杂到membane protein的markers 05/28 23:01
61F：→ nzj:上面没有讲清楚,是plasma membrane proteins 05/28 23:05
62F：→ Lccw:其实市面上的kit多少都还是会分不乾净的...... 05/29 01:54
63F：→ Lccw:T大其实已经说的很清楚~连原理都附给你了~真的= = 05/29 01:54
64F：→ nzj:我从头到尾都很感谢有人愿意回答这个问题 谢谢 05/29 08:45
65F：→ nzj:这个讨论串其实让我学到不少 05/29 09:00