作者nhxcyge (人生就像個不可逆反應)
看板Biotech
標題[求救] Far-western blot
時間Mon May 21 13:24:16 2012
請問各位版友們有沒有做過far-western blot，
目前想用這實驗看protein protein interaction。
老闆說的protocol感覺怪怪的，我列出來讓大家看一下。
1、將sample load到wells跑SDS-PAGE。
2、Transfer到nitrocellulose membrane。
3、利用欲看interaction的純化蛋白(prey)，加入TTBS，使最終濃度(1ug/mL)。
4、用可偵測prey的一抗去認，再用相對應的二抗去認。
我看到網路上有一些protocol是在第二步和第三步中間，有一個blocking的步驟。
想問一下比較正確的方法是什麼呢？
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◆ From: 140.114.95.199
1F：→ shenhsu:就跟一般western一樣 想要background乾淨一點就blocking啊 05/21 14:43
2F：→ nhxcyge:我在想在membrane的protein都已經denature了，所以用prey 05/21 15:04
3F：→ nhxcyge:再去跟bait反應時，會跟在細胞裡一樣有反應嗎？ 05/21 15:05
4F：→ nhxcyge:我是怕denature後的protein已經看不到interaction了@@ 05/21 15:05
5F：推 joseph103331:那為什麼不做IP? 應該有個理由吧... 05/21 23:23
6F：推 tsubasawolfy:不做ip應該是想省抗體錢還有相關器材？另外原po考量 05/21 23:32
7F：→ tsubasawolfy:是對的 你可以去問你老闆呀￣▽￣|| 05/21 23:32
8F：推 leoblack:抱歉~學藝不精~沒學過far-western blot,查了一下發現是 05/22 10:00
9F：→ leoblack:用non-Ab protein當probe~所以~strepavdin-biotin這種就 05/22 10:00
10F：→ leoblack:可以算是far-western blot的應用嘛?!感謝指教 05/22 10:01
11F：→ shenhsu:我以為是問blocking 抱歉XD 如果是denature問題 應該要跑 05/22 12:36
12F：→ shenhsu:native gel? 05/22 12:36
13F：→ nhxcyge:其實我做過IP，只是要說明protein-protein interaction 05/22 15:05
14F：→ nhxcyge:需要更多的DATA去證實XD 05/22 15:05
15F：推 williamyang:GST pull down 05/22 17:46
16F：推 joseph103331:推GST pull down...反過來用His也OK 05/22 23:16
17F：推 icome:Far-western不是很好做的樣子.. IP和GST算是目前主流 05/22 23:30
18F：推 kirby0415:transfer後用guanidine-HCl denature後,TTBS renature, 05/23 14:59
19F：→ kirby0415:milk blocking, 加入prey protein, 之後再加入可以認 05/23 15:00
20F：→ kirby0415:prey protein的Ab~我真心懷疑原po跟我當初同間lab..... 05/23 15:01
21F：→ nhxcyge:樓上是嗎XD 05/23 21:50