作者nhxcyge (人生就像个不可逆反应)
看板Biotech
标题[求救] Far-western blot
时间Mon May 21 13:24:16 2012
请问各位版友们有没有做过far-western blot，
目前想用这实验看protein protein interaction。
老板说的protocol感觉怪怪的，我列出来让大家看一下。
1、将sample load到wells跑SDS-PAGE。
2、Transfer到nitrocellulose membrane。
3、利用欲看interaction的纯化蛋白(prey)，加入TTBS，使最终浓度(1ug/mL)。
4、用可侦测prey的一抗去认，再用相对应的二抗去认。
我看到网路上有一些protocol是在第二步和第三步中间，有一个blocking的步骤。
想问一下比较正确的方法是什麽呢？
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.95.199
1F：→ shenhsu:就跟一般western一样 想要background乾净一点就blocking啊 05/21 14:43
2F：→ nhxcyge:我在想在membrane的protein都已经denature了，所以用prey 05/21 15:04
3F：→ nhxcyge:再去跟bait反应时，会跟在细胞里一样有反应吗？ 05/21 15:05
4F：→ nhxcyge:我是怕denature後的protein已经看不到interaction了@@ 05/21 15:05
5F：推 joseph103331:那为什麽不做IP? 应该有个理由吧... 05/21 23:23
6F：推 tsubasawolfy:不做ip应该是想省抗体钱还有相关器材？另外原po考量 05/21 23:32
7F：→ tsubasawolfy:是对的 你可以去问你老板呀￣▽￣|| 05/21 23:32
8F：推 leoblack:抱歉~学艺不精~没学过far-western blot,查了一下发现是 05/22 10:00
9F：→ leoblack:用non-Ab protein当probe~所以~strepavdin-biotin这种就 05/22 10:00
10F：→ leoblack:可以算是far-western blot的应用嘛?!感谢指教 05/22 10:01
11F：→ shenhsu:我以为是问blocking 抱歉XD 如果是denature问题 应该要跑 05/22 12:36
12F：→ shenhsu:native gel? 05/22 12:36
13F：→ nhxcyge:其实我做过IP，只是要说明protein-protein interaction 05/22 15:05
14F：→ nhxcyge:需要更多的DATA去证实XD 05/22 15:05
15F：推 williamyang:GST pull down 05/22 17:46
16F：推 joseph103331:推GST pull down...反过来用His也OK 05/22 23:16
17F：推 icome:Far-western不是很好做的样子.. IP和GST算是目前主流 05/22 23:30
18F：推 kirby0415:transfer後用guanidine-HCl denature後,TTBS renature, 05/23 14:59
19F：→ kirby0415:milk blocking, 加入prey protein, 之後再加入可以认 05/23 15:00
20F：→ kirby0415:prey protein的Ab~我真心怀疑原po跟我当初同间lab..... 05/23 15:01
21F：→ nhxcyge:楼上是吗XD 05/23 21:50