作者f52cya (SWD)
看板Biotech
標題[求救] IMAC純化His-tagged protein,Imidazole?
時間Tue May 8 19:48:06 2012
各位先進好:
小弟最近嘗試使用AKTA FPLC系統接上自行packing的管柱來做親和性層析
欲純化His-tagged 重組蛋白
使用的是GE的Ni sepharose 6 FF膠體
於管柱packing方面並沒有太大問題,也可以順利接上FPLC系統
我使用緩衝溶液成分為50mM Na2HPO4、300mM NaCl及Imidazole, pH8.0
FPLC系統泵浦分二,於是我配了Imidazole低濃度(0mM)及高濃度(500mM)的緩衝溶液
利用AB動相比例分配調Imidazole的濃度,
使得Binding、Wash、Elution分別為10mM、20mM、250mM
管柱經Binding的濃度平衡後,試打純水作流程測試
UV偵測器調整成三種坡長偵測(280、254、215nm)
結果發現當進行到elution的步驟時，訊號一下子升了很高(從10升到500mAU左右,280nm)
而且持平一段時間才降下來(約5CV,剛好是我Elution的時間)
於是我猜測是Imidazole本身的吸光導致,但也困惑了...
若Imidazole本身有吸收,這樣我欲純化的蛋白會不會就這樣而看不到有沖提出來
(我試著用其結構來猜測會有吸光,254nm應當一定有,280nm就不確定)
並且我翻了翻GE的產品目錄,在相關IMAC的產品介紹中,
也是使用Imidazole來做Elution並且濃度是500mM
但不同的是,在500mM的濃度下,除了沖提出來的蛋白峰之外,其餘時間的訊號很低不到50mAU
搜尋網路上有關於Imidazole的資訊,我也看到說Imidazole不會有吸光
因此...是我的Imidazole有問題嗎? 目前考慮重配
Imidazole究竟會不會吸280nm的光呢~?
謹請各位提點
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.164.140
1F：→ trumpet:imidazole在280nm會吸光(原po可直接用分光光度計測就知) 05/08 20:59
2F：→ trumpet:一般如果你的protein濃度太低，會被imidazole背景蓋掉 05/08 21:00
3F：→ trumpet:所以建議每個fraction都收集，然後用分光光度計另外再測一 05/08 21:01
4F：→ trumpet:我也在網路上看到說不會吸光的，但是我用的就是會吸光 05/08 21:02
5F：→ satantaco:wash時間拉長~~elute的梯度拉緩 或者program先拉一低 05/08 22:55
6F：→ satantaco:低濃度平衡後再拉梯度 參考看看嚕 很久沒碰了 05/08 22:55
修改倒數第五行單位
※ 編輯: f52cya 來自: 114.27.132.227 (05/08 23:21)
7F：→ f52cya:感謝樓上兩位大大幫忙! 05/08 23:24
8F：→ f52cya:其實我剛剛又再查了一下,發現如果是品質不佳的imidazole 05/09 00:11
9F：→ f52cya:會有吸光的問題,high quality的則幾乎沒有~ 05/09 00:11
10F：推 muscidae:的確是quality的關係,不過不至於會蓋過sample的吸光。 05/09 17:48