作者f52cya (SWD)
看板Biotech
标题[求救] IMAC纯化His-tagged protein,Imidazole?
时间Tue May 8 19:48:06 2012
各位先进好:
小弟最近尝试使用AKTA FPLC系统接上自行packing的管柱来做亲和性层析
欲纯化His-tagged 重组蛋白
使用的是GE的Ni sepharose 6 FF胶体
於管柱packing方面并没有太大问题,也可以顺利接上FPLC系统
我使用缓冲溶液成分为50mM Na2HPO4、300mM NaCl及Imidazole, pH8.0
FPLC系统泵浦分二,於是我配了Imidazole低浓度(0mM)及高浓度(500mM)的缓冲溶液
利用AB动相比例分配调Imidazole的浓度,
使得Binding、Wash、Elution分别为10mM、20mM、250mM
管柱经Binding的浓度平衡後,试打纯水作流程测试
UV侦测器调整成三种坡长侦测(280、254、215nm)
结果发现当进行到elution的步骤时，讯号一下子升了很高(从10升到500mAU左右,280nm)
而且持平一段时间才降下来(约5CV,刚好是我Elution的时间)
於是我猜测是Imidazole本身的吸光导致,但也困惑了...
若Imidazole本身有吸收,这样我欲纯化的蛋白会不会就这样而看不到有冲提出来
(我试着用其结构来猜测会有吸光,254nm应当一定有,280nm就不确定)
并且我翻了翻GE的产品目录,在相关IMAC的产品介绍中,
也是使用Imidazole来做Elution并且浓度是500mM
但不同的是,在500mM的浓度下,除了冲提出来的蛋白峰之外,其余时间的讯号很低不到50mAU
搜寻网路上有关於Imidazole的资讯,我也看到说Imidazole不会有吸光
因此...是我的Imidazole有问题吗? 目前考虑重配
Imidazole究竟会不会吸280nm的光呢~?
谨请各位提点
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.164.140
1F：→ trumpet:imidazole在280nm会吸光(原po可直接用分光光度计测就知) 05/08 20:59
2F：→ trumpet:一般如果你的protein浓度太低，会被imidazole背景盖掉 05/08 21:00
3F：→ trumpet:所以建议每个fraction都收集，然後用分光光度计另外再测一 05/08 21:01
4F：→ trumpet:我也在网路上看到说不会吸光的，但是我用的就是会吸光 05/08 21:02
5F：→ satantaco:wash时间拉长~~elute的梯度拉缓 或者program先拉一低 05/08 22:55
6F：→ satantaco:低浓度平衡後再拉梯度 参考看看噜 很久没碰了 05/08 22:55
修改倒数第五行单位
※ 编辑: f52cya 来自: 114.27.132.227 (05/08 23:21)
7F：→ f52cya:感谢楼上两位大大帮忙! 05/08 23:24
8F：→ f52cya:其实我刚刚又再查了一下,发现如果是品质不佳的imidazole 05/09 00:11
9F：→ f52cya:会有吸光的问题,high quality的则几乎没有~ 05/09 00:11
10F：推 muscidae:的确是quality的关系,不过不至於会盖过sample的吸光。 05/09 17:48