作者Azusa809 (Azusa)
看板Biotech
標題[求救] total Akt的量不一
時間Thu Apr 19 02:05:45 2012
最近在做Akt的western blot時發現，
total Akt的量似乎會受處理影響(induced apoptosis)，
但理論上處理應該只會影響Akt的活化量，
(每個lane間loading control-actin的量也一致)
看paper上total Akt的量都一樣，
實在不知道是他們的處理不會影響total Akt，
還是跑膠後，重新調整過total Akt的量。
不知道有沒人有經驗在壓p-Akt和total Akt時遇到類似的問題呢?
謝謝~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 59.121.5.64
1F：推 aggaci:actin一樣嗎 04/19 11:08
2F：推 FireHell:total包含phospho，phospho有變動理論上total就會有變動 04/19 12:46
3F：→ FireHell:只是因為常常non-phospho比phospho多很多，所以total看起 04/19 12:47
4F：→ FireHell:來沒差。也就是說，total有變動是沒關係的 04/19 12:48
5F：推 FireHell:可能你的細胞本身Akt就不多，所以total看的出差異 04/19 12:50
6F：→ blence:P有變動理論上total就會變動？ total只是P與non-P的總合阿 04/19 13:48
7F：→ blence:要是total是隨著phospho變化，那phospho就這件事就不重要了 04/19 13:52
8F：推 FireHell:抱歉我想修正"理論上"這三個字，用的不恰當 04/19 15:29
9F：→ FireHell:應該說"有可能"，我們必須考慮轉譯出新的non-p的可能性 04/19 15:31
10F：推 FireHell:整理："T不變、P有變" 和 "T隨P而變(同增同減)" => 合理 04/19 15:38
11F：→ FireHell:後者如果遇到non-P可"抑制"，P可"促進"的情形 04/19 15:38
12F：→ FireHell:可以用P/T ratio的定量結果去解釋 04/19 15:38
13F：推 FireHell:如果non-P"無功能"，P可"促進"，只看P的結果即可 04/19 15:43
14F：→ FireHell:前提當然是loading control藥一樣 04/19 15:44
15F：推 FireHell:最簡單的作法是，全部都用P/T raio去看摟，不過定量挺 04/19 15:48
16F：→ FireHell:麻煩的 04/19 15:48
17F：→ Azusa809:total actin是接近一樣的! 我目前也是採用定量看ratio 04/19 22:42
18F：→ Azusa809:去看差異，只是納悶是只有我這樣~還是這情形普遍會發生~ 04/19 22:43
19F：→ mesenchymal:有時候是因為你apoptosis太嚴重造成 04/19 23:14
20F：→ mesenchymal:actin訊號強所以看不出太大差異,但AKT就會有差 04/19 23:14
21F：→ mesenchymal:另外推F大的 P/T ratio 04/19 23:15
22F：推 FireHell:我也有幾個PROTEIN會這樣，不過不是Akt 04/19 23:37
23F：→ Azusa809:謝謝大家的幫忙~那我就先用ratio看了~請問大家遇到這種 04/20 00:15
24F：→ Azusa809:情形，若是有發表需要，是不是就直接按照total Akt量調整 04/20 00:17
25F：→ Azusa809:loading，再跑出漂亮的結果呢?? 04/20 00:17
26F：推 FireHell:不行啊，loading的protein量一定要一樣 04/20 00:20
27F：→ blence:要怎樣調整或定量校正，取決於你要強調的點,因此有些data 04/20 00:24
28F：→ blence:不放loading control而用total取代以強調phospho的差異 04/20 00:25
29F：推 ararthur:我有遇過 可以考慮drug treatment時間短些 04/20 13:06
30F：→ ararthur:對於mRNA Protein的變化 Post-modification 更能在短時間 04/20 13:06
31F：→ ararthur:內看到變化 所以如果很堅持想讓tAKT一樣 那就別treat太久 04/20 13:07
32F：推 raiyu:感謝大家的討論 我也遇到類似的問題 04/20 23:20
33F：→ Azusa809:謝謝大家幫忙!我會先再嘗試看RATIO或把處理時間縮短看看 04/21 22:18