作者mzac1b (Goodday)
看板Biotech
標題[討論] 使用PCR 產物去進行PCR 產生smear?
時間Fri Apr 13 17:11:00 2012
為了在cDNA clone 某約 160bp 的片段
已經得到PCR 產物，single band
原想說將PCR 產物稀釋再PCR 比較好P
但是稀釋不管 1/100000, 1/10000, 1/1000, 1/100
P 的結果都是嚴重的smear，約在數百至數千bp 位置產生smear
甚至做了gradient 溫度梯度仍然都是smear 的結果
看不見single band
但同條件用cDNA P 又得重新得到預期的single band
雖然我們後來決定乾脆還是由原本的cDNA 重頭來放大
但仍很好奇smear 怎產生的?
有人有同樣的經驗嗎?
感謝分享~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.200
1F：推 f9361046:你不覺的用PCR產物在進行PCR 非常不適當嗎 04/14 10:52
2F：推 kingbar:我有這種經驗!我想是原本的PCR產物雖然經過純化，但裡面 04/14 16:01
3F：→ kingbar:其實還有微量的non-specific band，因為長度比較短， 04/14 16:03
4F：→ kingbar:再次PCR時就比major band更容易被amplify，目前尚無解法XD 04/14 16:04
5F：→ kingbar:回一樓:有時從cDNA P出來真的很微量，但因實驗需求需要 04/14 16:06
6F：→ kingbar:較濃的產物，就會想試試這個方法。 04/14 16:07
7F：推 joseph103331:真的要用產物P 我會建議切膠elute後再P會比較好 04/14 18:13
8F：推 arlix:smear是因為第一輪的PCR產物中其實有許多Polymerase沒跑完 04/17 00:07
9F：→ arlix:所形成長短不一的片段，但在第一輪中的量不足在膠體中看見。 04/17 00:09
10F：→ arlix:然而在第二輪PCR時，這些訊號同時被放大，所以就產生了smear 04/17 00:09
11F：→ arlix:另外也推J大切膠出來當template. 04/17 00:10