作者mzac1b (Goodday)
看板Biotech
标题[讨论] 使用PCR 产物去进行PCR 产生smear?
时间Fri Apr 13 17:11:00 2012
为了在cDNA clone 某约 160bp 的片段
已经得到PCR 产物，single band
原想说将PCR 产物稀释再PCR 比较好P
但是稀释不管 1/100000, 1/10000, 1/1000, 1/100
P 的结果都是严重的smear，约在数百至数千bp 位置产生smear
甚至做了gradient 温度梯度仍然都是smear 的结果
看不见single band
但同条件用cDNA P 又得重新得到预期的single band
虽然我们後来决定乾脆还是由原本的cDNA 重头来放大
但仍很好奇smear 怎产生的?
有人有同样的经验吗?
感谢分享~
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◆ From: 210.60.122.200
1F：推 f9361046:你不觉的用PCR产物在进行PCR 非常不适当吗 04/14 10:52
2F：推 kingbar:我有这种经验!我想是原本的PCR产物虽然经过纯化，但里面 04/14 16:01
3F：→ kingbar:其实还有微量的non-specific band，因为长度比较短， 04/14 16:03
4F：→ kingbar:再次PCR时就比major band更容易被amplify，目前尚无解法XD 04/14 16:04
5F：→ kingbar:回一楼:有时从cDNA P出来真的很微量，但因实验需求需要 04/14 16:06
6F：→ kingbar:较浓的产物，就会想试试这个方法。 04/14 16:07
7F：推 joseph103331:真的要用产物P 我会建议切胶elute後再P会比较好 04/14 18:13
8F：推 arlix:smear是因为第一轮的PCR产物中其实有许多Polymerase没跑完 04/17 00:07
9F：→ arlix:所形成长短不一的片段，但在第一轮中的量不足在胶体中看见。 04/17 00:09
10F：→ arlix:然而在第二轮PCR时，这些讯号同时被放大，所以就产生了smear 04/17 00:09
11F：→ arlix:另外也推J大切胶出来当template. 04/17 00:10