作者keroromoa (傻傻)
看板Biotech
標題[求救]無法用Western Blot跑出有活性的Caspase-3
時間Wed Apr 11 18:22:53 2012
由於TNF-α是一個引起apoptosis的factor，
因此我們認為將細胞用TNF-α處理後會增加凋亡蛋白如Caspase-3的表現量。
並使pro-form的Caspase-3自我裂解成activated-form
我使用的細胞是G6PD正常和缺乏的嗜中性球（直接從正常人和病人抽血得到），
然後再將正常和缺乏的細胞以TNF-α分別處理3，4，6小時
（以上的步驟都是學姐處理好的，下面的才是我做的）
接下來就是以PBS wash，加入lysis buffer萃取出蛋白，再用Braford assay測蛋白濃度
最後將細胞，二次水和Western loading buffer混合配成sample，
每個sample都含有25μg的蛋白。
之後就是進行Western的步驟：蛋白質電泳，Transfer等等
然後我的一抗是anti-Caspase-3
它在分子量36的地方會出現pro-form，在17和19會出現activated-form
而二抗是新配的Mouse
－－－－－以上是大致的實驗方法，如果版友有需要我可以再打得更詳細－－－－－
可是最後的結果是，pro-form沒有問題，
但activated-form，學姊在17和19都有跑出來，但我的卻沒有，或是有但表現很淡
而我和學姊都用相同的一抗和二抗
請問造成我activated-form Caspase-3無法跑出來的原因可能是什麼呢？
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◆ From: 163.25.118.137
※ 編輯: keroromoa 來自: 163.25.118.137 (04/11 20:18)
1F：推 FireHell:一抗有REUSE嗎？有的話建議重配 04/11 22:05
2F：推 kirby0415:有確定treat的dose會造成細胞的apoptosis嗎? 04/11 22:06
3F：→ kirby0415:要不要另外多壓一個PARP試試? 04/11 22:06
4F：→ kirby0415:有的時候實驗換人做,condition還是要再抓一下... 04/11 22:08
5F：→ keroromoa:感謝建議，我重新確認material和condtion有沒有問題好了 04/11 23:34
6F：推 warmheaven:有沒有收上清液的細胞阿? 04/14 16:14
7F：→ keroromoa:沒有 04/14 21:23
8F：→ Azusa809:可以請問你用哪間廠商的抗體嗎? 04/19 02:09