作者keroromoa (傻傻)
看板Biotech
标题[求救]无法用Western Blot跑出有活性的Caspase-3
时间Wed Apr 11 18:22:53 2012
由於TNF-α是一个引起apoptosis的factor，
因此我们认为将细胞用TNF-α处理後会增加凋亡蛋白如Caspase-3的表现量。
并使pro-form的Caspase-3自我裂解成activated-form
我使用的细胞是G6PD正常和缺乏的嗜中性球（直接从正常人和病人抽血得到），
然後再将正常和缺乏的细胞以TNF-α分别处理3，4，6小时
（以上的步骤都是学姐处理好的，下面的才是我做的）
接下来就是以PBS wash，加入lysis buffer萃取出蛋白，再用Braford assay测蛋白浓度
最後将细胞，二次水和Western loading buffer混合配成sample，
每个sample都含有25μg的蛋白。
之後就是进行Western的步骤：蛋白质电泳，Transfer等等
然後我的一抗是anti-Caspase-3
它在分子量36的地方会出现pro-form，在17和19会出现activated-form
而二抗是新配的Mouse
－－－－－以上是大致的实验方法，如果版友有需要我可以再打得更详细－－－－－
可是最後的结果是，pro-form没有问题，
但activated-form，学姊在17和19都有跑出来，但我的却没有，或是有但表现很淡
而我和学姊都用相同的一抗和二抗
请问造成我activated-form Caspase-3无法跑出来的原因可能是什麽呢？
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.137
※ 编辑: keroromoa 来自: 163.25.118.137 (04/11 20:18)
1F：推 FireHell:一抗有REUSE吗？有的话建议重配 04/11 22:05
2F：推 kirby0415:有确定treat的dose会造成细胞的apoptosis吗? 04/11 22:06
3F：→ kirby0415:要不要另外多压一个PARP试试? 04/11 22:06
4F：→ kirby0415:有的时候实验换人做,condition还是要再抓一下... 04/11 22:08
5F：→ keroromoa:感谢建议，我重新确认material和condtion有没有问题好了 04/11 23:34
6F：推 warmheaven:有没有收上清液的细胞阿? 04/14 16:14
7F：→ keroromoa:没有 04/14 21:23
8F：→ Azusa809:可以请问你用哪间厂商的抗体吗? 04/19 02:09