作者md183 (十月的兔子)
看板Biotech
標題[求救] iNOS跑出來的band
時間Mon Apr 9 17:36:26 2012
大家好我已經有用關鍵字查過相關的問題了
但是還是有遇到不解的地方
最近在壓iNOS和COX-2這兩種抗體 (cell signaling)
iNOS 圖
http://i.imgur.com/3VBDW.jpg
COX-2 圖
http://i.imgur.com/MDXbI.png
一抗 (1:2000)
二抗 (1:1000)
iNOS跑出來很淡，而且有一點一點雜訊的感覺
COX-2是有跑出來，但是跑出來的範圍就不平均，像一坨一坨的感覺
我好奇的是iNOS的為什麼會那麼淡，是抗體稀釋太過頭了嗎?
那COX-2為什麼又跑出來不好看，看paper上大家壓得都很有beta-actin的感覺...
會是收細胞(巨噬細胞)的問題嗎?
請有經驗的人幫忙看看並幫忙解惑~~~謝謝> <
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每個人都把希望寄託在未來，
卻忘了未來是由每個現在所組成。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.143.163
1F：推 martyrtitan:blocking多久? 04/09 19:20
2F：→ md183:大約都1個小時~頂多不會超過兩個小時 04/09 23:38
3F：推 mingchao:蛋白是不是沒抽好~什麼細胞?處理多久? 04/10 12:18
4F：→ md183:RAW264.7巨噬細胞。是說抽細胞的時後，lysis buffer加進去收 04/10 13:06
5F：→ md183:時蛋白液會呈現黏稠狀，所以用離心抽取方式取上清液。 04/10 13:08
6F：→ md183:不然實驗室收蛋白液是不會用到離心機的.. 04/10 13:09
7F：推 martyrtitan:blocking久一點 4度c可以overnight..另外二抗太濃了 04/10 23:51
8F：→ martyrtitan:cell signaling的rabbit、mouse我都1:5000 04/10 23:51
9F：→ martyrtitan:另外你蛋白質量loading多少? transfer條件? 04/10 23:52
10F：→ md183:每孔load 入10ul~約20ug。跑膠時上膠60V 20分鐘，下膠120V 04/11 10:07
11F：→ md183:約80分鐘，轉漬是0.4V 60分鐘左右~ 大概是這樣Q Q 04/11 10:08
12F：→ md183:不知為什麼iNOS跑出來都這樣 ... 04/11 10:08
13F：推 Tendin1015:我們也有跑 iNOS..應該不是你蛋白收得不好，頂多是保存 04/11 15:35
14F：→ Tendin1015:不好..細胞lysis之後黏稠物是DNA，離心把上清移到新的 04/11 15:37
15F：→ Tendin1015:eppendorf，然後再去跑，你應該是抽到雜質了 04/11 15:38
16F：→ md183:謝謝你們～~iNOS我blocking久一點~~背景雜質不見很多哩 04/16 17:26
17F：推 bigpobatin:破細胞的lysis buffer配方可能有問題 04/16 20:48
18F：→ md183:我也覺得有這可能耶!!!!@ @但我們家lysis buffer是用買的 04/17 15:58
19F：→ md183:但收不同細胞跑其他的抗體卻沒有這種問題Q ~ Q 04/17 15:58