作者md183 (十月的兔子)
看板Biotech
标题[求救] iNOS跑出来的band
时间Mon Apr 9 17:36:26 2012
大家好我已经有用关键字查过相关的问题了
但是还是有遇到不解的地方
最近在压iNOS和COX-2这两种抗体 (cell signaling)
iNOS 图
http://i.imgur.com/3VBDW.jpg
COX-2 图
http://i.imgur.com/MDXbI.png
一抗 (1:2000)
二抗 (1:1000)
iNOS跑出来很淡，而且有一点一点杂讯的感觉
COX-2是有跑出来，但是跑出来的范围就不平均，像一坨一坨的感觉
我好奇的是iNOS的为什麽会那麽淡，是抗体稀释太过头了吗?
那COX-2为什麽又跑出来不好看，看paper上大家压得都很有beta-actin的感觉...
会是收细胞(巨噬细胞)的问题吗?
请有经验的人帮忙看看并帮忙解惑~~~谢谢> <
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每个人都把希望寄托在未来，
却忘了未来是由每个现在所组成。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.143.163
1F：推 martyrtitan:blocking多久? 04/09 19:20
2F：→ md183:大约都1个小时~顶多不会超过两个小时 04/09 23:38
3F：推 mingchao:蛋白是不是没抽好~什麽细胞?处理多久? 04/10 12:18
4F：→ md183:RAW264.7巨噬细胞。是说抽细胞的时後，lysis buffer加进去收 04/10 13:06
5F：→ md183:时蛋白液会呈现黏稠状，所以用离心抽取方式取上清液。 04/10 13:08
6F：→ md183:不然实验室收蛋白液是不会用到离心机的.. 04/10 13:09
7F：推 martyrtitan:blocking久一点 4度c可以overnight..另外二抗太浓了 04/10 23:51
8F：→ martyrtitan:cell signaling的rabbit、mouse我都1:5000 04/10 23:51
9F：→ martyrtitan:另外你蛋白质量loading多少? transfer条件? 04/10 23:52
10F：→ md183:每孔load 入10ul~约20ug。跑胶时上胶60V 20分钟，下胶120V 04/11 10:07
11F：→ md183:约80分钟，转渍是0.4V 60分钟左右~ 大概是这样Q Q 04/11 10:08
12F：→ md183:不知为什麽iNOS跑出来都这样 ... 04/11 10:08
13F：推 Tendin1015:我们也有跑 iNOS..应该不是你蛋白收得不好，顶多是保存 04/11 15:35
14F：→ Tendin1015:不好..细胞lysis之後黏稠物是DNA，离心把上清移到新的 04/11 15:37
15F：→ Tendin1015:eppendorf，然後再去跑，你应该是抽到杂质了 04/11 15:38
16F：→ md183:谢谢你们～~iNOS我blocking久一点~~背景杂质不见很多哩 04/16 17:26
17F：推 bigpobatin:破细胞的lysis buffer配方可能有问题 04/16 20:48
18F：→ md183:我也觉得有这可能耶!!!!@ @但我们家lysis buffer是用买的 04/17 15:58
19F：→ md183:但收不同细胞跑其他的抗体却没有这种问题Q ~ Q 04/17 15:58