作者ch90331 (迷途羔羊)
看板Biotech
標題[求救] Western blot nuclear protein
時間Wed Apr 4 22:46:58 2012
大家好
最近想抽cytoplasmic protein 和 nuclear protein
使用的方法是老師提供的配方 原理大致是利用滲透壓的方式
也就是先利用Hypotonic buffer去脹破細胞膜 最後使用Hypertonic buffer來取細胞
核蛋白
但在使用hypotonic buffer作用於細胞時 要避免作用時間太久 同時也把核膜弄破
因此要做一個預實驗 先抓出一個時間點 這個時間點可以剛好讓質膜破掉又不會破壞核膜
採用的方法是用trypan blue 染色 去顯微鏡下觀察 若細胞質的部分全變藍色
表示質膜應已破 所以最好的情形是我會在細胞看到中間的核未被染上而呈現亮亮的情形
嗎?
預計作用時間大致於2~5 mins 所以我應該在hypotonic buffer一加到細胞後便到顯微鏡
下觀察整個細胞染色的情形嗎? (也就是觀察染色動態....)
是真的有必要這麼麻煩嗎? 因為看網路上的protocol也沒有特別註明要到顯微鏡下觀察
而且核膜真的有這麼容易破嗎? 因為在加入hypertonic buffer後取核蛋白還要作用
30 mins耶 如果真這麼脆弱 後面的作用方式有必要那麼久嗎?
希望有經驗的前輩可以分享經驗 或是有什麼比較好的方法可以提供呢?
麻煩解答了, 感激不盡~~~
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◆ From: 101.14.144.225
1F：→ Ianthegood:顯微鏡下觀察2-5分鐘你嫌麻煩... 04/04 22:50
2F：→ Ianthegood:而且兩個mechanism不同 04/04 22:52
3F：→ blence:覺得會染色後呈現一部分核破一部分膜還沒破的情況,還有死細 04/04 23:43
4F：→ blence:胞的干擾 04/04 23:43
5F：→ blence:我看到的方法是用1~30min取cyto後,再用WB觀察最佳的時間點 04/04 23:49
6F：→ tengjing:去染nuc/cyto protein 會比較可信吧 04/07 16:18