作者ch90331 (迷途羔羊)
看板Biotech
标题[求救] Western blot nuclear protein
时间Wed Apr 4 22:46:58 2012
大家好
最近想抽cytoplasmic protein 和 nuclear protein
使用的方法是老师提供的配方 原理大致是利用渗透压的方式
也就是先利用Hypotonic buffer去胀破细胞膜 最後使用Hypertonic buffer来取细胞
核蛋白
但在使用hypotonic buffer作用於细胞时 要避免作用时间太久 同时也把核膜弄破
因此要做一个预实验 先抓出一个时间点 这个时间点可以刚好让质膜破掉又不会破坏核膜
采用的方法是用trypan blue 染色 去显微镜下观察 若细胞质的部分全变蓝色
表示质膜应已破 所以最好的情形是我会在细胞看到中间的核未被染上而呈现亮亮的情形
吗?
预计作用时间大致於2~5 mins 所以我应该在hypotonic buffer一加到细胞後便到显微镜
下观察整个细胞染色的情形吗? (也就是观察染色动态....)
是真的有必要这麽麻烦吗? 因为看网路上的protocol也没有特别注明要到显微镜下观察
而且核膜真的有这麽容易破吗? 因为在加入hypertonic buffer後取核蛋白还要作用
30 mins耶 如果真这麽脆弱 後面的作用方式有必要那麽久吗?
希望有经验的前辈可以分享经验 或是有什麽比较好的方法可以提供呢?
麻烦解答了, 感激不尽~~~
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◆ From: 101.14.144.225
1F：→ Ianthegood:显微镜下观察2-5分钟你嫌麻烦... 04/04 22:50
2F：→ Ianthegood:而且两个mechanism不同 04/04 22:52
3F：→ blence:觉得会染色後呈现一部分核破一部分膜还没破的情况,还有死细 04/04 23:43
4F：→ blence:胞的干扰 04/04 23:43
5F：→ blence:我看到的方法是用1~30min取cyto後,再用WB观察最佳的时间点 04/04 23:49
6F：→ tengjing:去染nuc/cyto protein 会比较可信吧 04/07 16:18