作者chen95982000 (元元)
看板Biotech
標題[求救] histone的western blot
時間Mon Apr 2 16:27:25 2012
我們要看的是non phospho-H2AX
sample 都是whole cell lysate, 然後顯色我們是用ECL,
non phospho-H2AX一直都沒有band
internal control我們用beta actin 有非常清楚的band
transfer buffer我們用的是:
25mM Tris-base, 192mM glycine, 20% methanol, pH8.3
膜用的是0.45 um pore size 的 PVDF
tansfer time: 250 mA, 2 hr
我看到histone的PI值好像是9, 10左右
所以主要原因是transfer buffer的pH值問題嗎? 或是0.45 um這個膜的pore size太大?
我如果調高transfer buffer的pH是不是又會影響其他protein的transfer?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.121.239
1F：推 tsubasawolfy:當你sds上去後pi啥鬼都一樣 PVDF不會 你可以試試不同 04/02 17:41
2F：→ blence:說不定是extraction的問題，用PSB煮就可以確認了 04/02 17:41
3F：→ tsubasawolfy:家Ab或者可以拿到純H2AX protein去證明你的一抗問題 04/02 17:43
4F：→ tsubasawolfy:或者抽核蛋白 因為一般lysis buffer(沒加sds)不容易 04/02 17:43
5F：→ tsubasawolfy:把histone從DNA上扯下來 最直接方法就是細胞收好加 04/02 17:44
6F：→ tsubasawolfy:1X sample buffer煮一煮離心跑膠（跟你的lysis比 04/02 17:45
7F：→ a90648:可以參考abcam的抽histone的方法 04/02 20:52
8F：推 kakaman:做過磷酸化的,抗體是Abcam的樣子,似乎不難壓~ 04/03 19:00
9F：→ chen95982000:樓上有做磷酸化的話不是也都會做非磷酸化的當做 04/04 22:14
10F：→ chen95982000:control嗎? 就是"total的H2AX" 04/04 22:14
11F：推 kakaman:因為沒錢買普通的... 04/05 13:54