作者chen95982000 (元元)
看板Biotech
标题[求救] histone的western blot
时间Mon Apr 2 16:27:25 2012
我们要看的是non phospho-H2AX
sample 都是whole cell lysate, 然後显色我们是用ECL,
non phospho-H2AX一直都没有band
internal control我们用beta actin 有非常清楚的band
transfer buffer我们用的是:
25mM Tris-base, 192mM glycine, 20% methanol, pH8.3
膜用的是0.45 um pore size 的 PVDF
tansfer time: 250 mA, 2 hr
我看到histone的PI值好像是9, 10左右
所以主要原因是transfer buffer的pH值问题吗? 或是0.45 um这个膜的pore size太大?
我如果调高transfer buffer的pH是不是又会影响其他protein的transfer?
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◆ From: 140.112.121.239
1F：推 tsubasawolfy:当你sds上去後pi啥鬼都一样 PVDF不会 你可以试试不同 04/02 17:41
2F：→ blence:说不定是extraction的问题，用PSB煮就可以确认了 04/02 17:41
3F：→ tsubasawolfy:家Ab或者可以拿到纯H2AX protein去证明你的一抗问题 04/02 17:43
4F：→ tsubasawolfy:或者抽核蛋白 因为一般lysis buffer(没加sds)不容易 04/02 17:43
5F：→ tsubasawolfy:把histone从DNA上扯下来 最直接方法就是细胞收好加 04/02 17:44
6F：→ tsubasawolfy:1X sample buffer煮一煮离心跑胶（跟你的lysis比 04/02 17:45
7F：→ a90648:可以参考abcam的抽histone的方法 04/02 20:52
8F：推 kakaman:做过磷酸化的,抗体是Abcam的样子,似乎不难压~ 04/03 19:00
9F：→ chen95982000:楼上有做磷酸化的话不是也都会做非磷酸化的当做 04/04 22:14
10F：→ chen95982000:control吗? 就是"total的H2AX" 04/04 22:14
11F：推 kakaman:因为没钱买普通的... 04/05 13:54