作者sylvialalala (sylvia)
看板Biotech
標題[求救] long pcr p不出來
時間Sat Mar 24 15:32:21 2012
目標是15k的genomic dna
使用了好幾種方法都P不出來
Polymerase是kapa的long range hotstart pcr
號稱最多可P到20k
我的做法:
一開始怎麼P都是smear，懷疑是primer太短(20 bp)_
後來改成28~30 bp的primer去p
一開始夾不到東西，後來降低annealing溫度(TM-10度)
還有加上普通的TAG(TOP TEN)以1:1,16:1去P
夾的到東西但都是10K以下
有加上NESTED方法去P但都是SMEAR
做法是根據PROTOCAL
94度C 3分
94 25秒
tm-10 15秒
68 15分 共10 cycle
94 25秒
tm-5 15秒
68 15分加上每cycle增加20秒 共25cycle
72度c 15分
請問我該怎麼調整呢
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.29.210
1F：推 crazybrian:genomic DNA濃度也有影響~可以稀釋看看 03/24 18:00
2F：推 Ianthegood:annealing加長有時候會有用 03/24 19:42
3F：→ sylvialalala:我的dna濃度只有20~70 ng，這樣還需要稀釋嗎？ 03/24 21:50
4F：→ sylvialalala:另外爬文有看到增加denature的時間，請問這樣有用嗎 03/24 21:50
5F：→ keepseaching:你的Tm值是幾度阿，會smear有可能是primer專一性不夠 03/25 02:30
6F：→ keepseaching:若這是要用在construct上，只能加長primer提高Tm值 03/25 02:32
7F：推 micocat:可以試試看提高denature溫度 98度之類的 03/25 10:18
8F：推 lesswind:還是你要分兩段夾... 03/25 13:57
9F：推 joseph103331:genomics這個濃度可能還太高 kapa不是有說明書? 03/27 11:45
10F：→ joseph103331:看看上面怎麼寫 PCR煩就煩在一定要做出來才知條件... 03/27 11:45
11F：→ sylvialalala:tm 55 P不到後改50又p到太多～所以目前用53,54度 03/27 21:17
12F：→ sylvialalala:kapa上面沒有特別說，但我有去看他的example濃度差 03/27 21:18
13F：→ sylvialalala:不多說～目前有提高denature時間但不敢提高溫度怕酵 03/27 21:19
14F：→ sylvialalala:素失效～ 03/27 21:19