作者sylvialalala (sylvia)
看板Biotech
标题[求救] long pcr p不出来
时间Sat Mar 24 15:32:21 2012
目标是15k的genomic dna
使用了好几种方法都P不出来
Polymerase是kapa的long range hotstart pcr
号称最多可P到20k
我的做法:
一开始怎麽P都是smear，怀疑是primer太短(20 bp)_
後来改成28~30 bp的primer去p
一开始夹不到东西，後来降低annealing温度(TM-10度)
还有加上普通的TAG(TOP TEN)以1:1,16:1去P
夹的到东西但都是10K以下
有加上NESTED方法去P但都是SMEAR
做法是根据PROTOCAL
94度C 3分
94 25秒
tm-10 15秒
68 15分 共10 cycle
94 25秒
tm-5 15秒
68 15分加上每cycle增加20秒 共25cycle
72度c 15分
请问我该怎麽调整呢
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.29.210
1F：推 crazybrian:genomic DNA浓度也有影响~可以稀释看看 03/24 18:00
2F：推 Ianthegood:annealing加长有时候会有用 03/24 19:42
3F：→ sylvialalala:我的dna浓度只有20~70 ng，这样还需要稀释吗？ 03/24 21:50
4F：→ sylvialalala:另外爬文有看到增加denature的时间，请问这样有用吗 03/24 21:50
5F：→ keepseaching:你的Tm值是几度阿，会smear有可能是primer专一性不够 03/25 02:30
6F：→ keepseaching:若这是要用在construct上，只能加长primer提高Tm值 03/25 02:32
7F：推 micocat:可以试试看提高denature温度 98度之类的 03/25 10:18
8F：推 lesswind:还是你要分两段夹... 03/25 13:57
9F：推 joseph103331:genomics这个浓度可能还太高 kapa不是有说明书? 03/27 11:45
10F：→ joseph103331:看看上面怎麽写 PCR烦就烦在一定要做出来才知条件... 03/27 11:45
11F：→ sylvialalala:tm 55 P不到後改50又p到太多～所以目前用53,54度 03/27 21:17
12F：→ sylvialalala:kapa上面没有特别说，但我有去看他的example浓度差 03/27 21:18
13F：→ sylvialalala:不多说～目前有提高denature时间但不敢提高温度怕酵 03/27 21:19
14F：→ sylvialalala:素失效～ 03/27 21:19