作者euphonium15 (心動夢幻)
看板Biotech
標題[求救] 養大腸桿菌的問題
時間Sat Mar 10 10:17:45 2012
各位板友好：
這次是小弟第一次養細菌，不過實驗失敗了T ^ T
實驗是養大腸桿菌，從-80度冰箱取100 uL的大腸桿菌溶在5 mL LB裡面。
之後放到恆溫培養箱裡面，37度、200 rpm培養8小時，結果溶液超清澈Orz
想請教一下，因為實驗室沒有-80度冰箱，因此是寄放在其它實驗室。
做實驗前會將細菌取出，放到實驗室-20度的冰箱保存。
開始實驗時則會轉到一般冰箱上方的冷凍庫預備。
不過因為一些因素擺了一天左右的時間，不知道這樣是否會造成細菌死亡？！
仔細想了整個實驗過程，覺得應該是溫度的因素造成細菌死亡，溶液才會超清澈。
不然就是從-80度冰箱取100 uL的大腸桿菌的時候，因為沒有做抽吸的動作混合溶液。
造成其實我只抽到100 uL的甘油，不知道這有沒有機會發生？！
本來今天要再做一次實驗來驗證一些推測，不過對方實驗室沒開門。
拿不到細菌做實驗，只好先來這邊問有經驗的板友，希望可以提供一些意見。
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◆ From: 1.169.175.227
1F：推 crazybrian:抗生素確定一下有沒有加錯? 可以養12-16小時! 03/10 12:11
2F：→ crazybrian:要養菌時直接從-80度挖點菌拿就好 不用等菌退冰! 03/10 12:13
感謝C大，的確有人建議我直接挖，不用這樣緩慢升溫。
3F：→ puec2:凍菌的時候有沒有加glycerol? 03/10 15:59
回覆P大，這點應該是沒有問題才對。
4F：推 qiet:100ulin 5ml八小時應該會有了 會不會沒凍好? 甘油和菌有無混 03/10 16:46
5F：→ qiet:勻 03/10 16:47
Q大您好，這點我就沒辦法確定，個人就是擔心沒有混勻XDDD
6F：推 icome:原本菌液就有問題了吧 E.coli隨便沾一下就會長了 03/10 17:42
7F：→ turtle24:就算不勻也不可能只抽到甘油連一隻細菌都沒沾到呀 03/10 19:38
關於這點，得到的溶液確實非常清澈Orz
感謝上面的板友幫忙，這兩天會再重複做一次實驗。
實驗室還有其它管可以使用，小弟會拿其它管及有問題的那管一起測試。
主要是想釐清哪個環節有問題，避免重蹈覆轍。
其實還是比較擔心溫度的問題，下次會直接從-80度取出使用^^
※ 編輯: euphonium15 來自: 1.169.175.227 (03/10 21:41)
8F：推 Realthugz:做抽吸的動作死更大吧... 03/10 21:46
請教R大，為什麼會死更大呢？！
9F：→ Realthugz:出了放到冰上一下下 沒人像你那樣退冰的... 這麼搞剛 03/10 21:48
另外就是放到冰上的意思應該是做之前，放到冰塊裡面對嗎？
10F：→ Realthugz:最有可能是抗生素或那管菌/整盒都壞掉了 03/10 21:49
※ 編輯: euphonium15 來自: 1.169.175.227 (03/10 22:08)
11F：推 Ianthegood:抗生素+1 一摳賴沒有那麼容易死 03/10 23:44
12F：推 dodomilk:抗生素+1 e.coli只要沾到一顆就會長 03/11 16:06
13F：→ dodomilk:退冰過程根本沒差 別說-20度 4度C放一個禮拜都不會怎樣 03/11 16:07
14F：→ blence:說抗生素問題,除非拿錯了,否則就算只是壞了為何長不起來 03/11 16:13
15F：→ dodomilk:就是說拿錯了啊...原po的菌是從別的實驗室拿來的 03/11 16:27
雖然說是放在別的實驗室，不過有自己實驗室專屬的盒子應該是不會拿錯^^
16F：→ dodomilk:搞不好別的實驗室建構的construct用的抗生素不一樣 03/11 16:28
17F：推 joseph103331:就不要加抗生素養養看嘛 又花不了多少時間= =" 03/11 17:48
實驗室有配好的LB溶液，取5 mL之後加入100 uL的E.coli甘油溶液後，理論上就會生長。
關於上面幾位板友提到的抗生素，小弟真的不太清楚，這點自己會先去查查文獻。
※ 編輯: euphonium15 來自: 1.169.175.227 (03/11 18:21)
18F：推 lyu0001:是誰教你這樣養細菌的... 03/11 19:05
19F：推 leoblack:.......天啊~怎麼這樣養菌的?! 03/11 19:33
20F：推 leoblack:有一本書叫做molecular cloning,請好好地查閱一下= =" 03/11 19:36
兩位板友好，自己實驗室本來就不是專長於細菌這一塊領域。
不過還是有部分學生從事這方面研究，本是想說他們都養的起來應該是沒甚麼問題才對。
※ 編輯: euphonium15 來自: 1.169.175.227 (03/11 20:53)
21F：推 whatc21:確定好實驗室配的LB有沒有加抗生素,若沒有的話,你的無菌操 03/12 00:31
22F：→ whatc21:作真的是挺優秀的@@a 03/12 00:31
23F：推 whatc21:如一樓大大所說,你可以養久一點,我們實驗室都養到16-18hr 03/12 00:34
24F：推 dodomilk:實驗室有配好的LB 然後不曉得要加抗生素 03/12 05:52
25F：→ dodomilk:帶你做實驗的人應該拖出來罵一下 03/12 05:52
26F：→ dodomilk:幾乎每個實驗室都會養e.coli，跟專長是不是在細菌沒關... 03/12 05:53
27F：→ dodomilk:我想你們實驗室已經配好的LB應該是加了抗生素 03/12 05:55
28F：→ dodomilk:但是你要養的菌對這種抗生素沒有抗性 所以長不起來 03/12 05:55
29F：推 philip1205:不用畫盤? 03/12 12:20
30F：推 lyu0001:找人教比較快，最好是看哪個實驗室願意讓你在旁邊看怎麼做 03/12 15:00
31F：→ lyu0001:真的不是三言兩語就可以說得清楚的 03/12 15:01
32F：推 icome:原PO感覺很菜 大家不要太兇啦XD 03/12 20:58
33F：→ icome:找個有經驗的人問一下 在這邊很難搞懂你的問題出在哪 03/12 20:59
感謝樓上幾位，小弟真的很菜>"<
※ 編輯: euphonium15 來自: 140.114.45.131 (03/19 21:33)