作者popopig2000 (Chingching)
看板Biotech
標題[求救] PCR一直有band
時間Sat Mar 3 17:53:47 2012
大家好
實驗希望以real-time pcr方式
量化轉染效率
於是設計一段primer可以夾出質體上的片段
primer所夾的位置位於質體上的
lac operon sequence到ori的區域
預期所夾出來的片段為140 bp
此primer已做過blast不會抓到任何human genomic DNA
但是不知為什麼
就算沒有transfect的細胞或是只用ddH2O當negative ctrl
都還是有訊號被偵測到
例如有轉染的細胞Ct值大概是12-13
但沒轉染的細胞或ddH2O,Ct值也有22-23
做了不同次, 不同sample也是一樣
使用的reagent已全部換新也是一樣的結果
請問板上的高手什麼會這樣呢?
好困擾呀, 拜託各位了!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.60
1F：→ mzac1b:既然有band就拿去定序看看? 03/03 17:59
2F：推 qiet:有跑過膠?大小也是140bp? 03/03 18:08
3F：推 zoom8080:primer dimer? 有看過melting curve嗎? 03/03 19:07
4F：→ popopig2000:跑膠的大小也是140 bp, melting curve也是完全重疊 03/03 19:47
5F：→ popopig2000:一樣的位置 03/03 19:48
6F：→ popopig2000:全部的sample都只出現一條band且都在相同位置 03/03 19:49
7F：→ popopig2000:為了排除抽DNA污染,也有跟同學借DNA來跑, 也是有band! 03/03 19:50
8F：→ popopig2000:感謝1,2,3樓的回覆, 到底為什麼會這樣啊? 03/03 19:52
9F：推 mesenchymal:連只有水的也有140 bp那條band嗎?? 03/03 20:44
10F：→ solomo:重新設計 1.換位置 2.加長primer 3.提高primer等級 03/03 22:58
11F：→ solomo:也可能是整套實驗器材汙染 03/03 22:59
12F：→ Anvec:primer 被汙染了? 03/03 23:38
13F：→ Ianthegood:也是正確size大概是污染吧 03/04 00:10
14F：→ popopig2000:全部的東西都有重配, primer是拿stock再稀釋 03/04 13:09
15F：→ popopig2000:所以是stock污染嗎? 03/04 13:10
16F：→ popopig2000:沒錯,只有水的也只有140的band! 03/04 13:11
17F：→ decyen:pipetman汙染? 03/04 14:08
18F：→ mzac1b:所以要買新的primer 來測試嗎 @@!! 03/04 14:57
19F：推 icome:汙染了 所有的東西換新的 連pipetman都要清 03/04 16:39
20F：→ popopig2000:謝謝大家的意見, 我已經訂了新的primer, 並且重新設計 03/05 22:09
21F：→ puec2:pipetman汙染啦 03/07 15:03
22F：→ puec2:你改用filter tip試試看就知道了。 03/07 15:05