作者popopig2000 (Chingching)
看板Biotech
标题[求救] PCR一直有band
时间Sat Mar 3 17:53:47 2012
大家好
实验希望以real-time pcr方式
量化转染效率
於是设计一段primer可以夹出质体上的片段
primer所夹的位置位於质体上的
lac operon sequence到ori的区域
预期所夹出来的片段为140 bp
此primer已做过blast不会抓到任何human genomic DNA
但是不知为什麽
就算没有transfect的细胞或是只用ddH2O当negative ctrl
都还是有讯号被侦测到
例如有转染的细胞Ct值大概是12-13
但没转染的细胞或ddH2O,Ct值也有22-23
做了不同次, 不同sample也是一样
使用的reagent已全部换新也是一样的结果
请问板上的高手什麽会这样呢?
好困扰呀, 拜托各位了!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.60
1F：→ mzac1b:既然有band就拿去定序看看? 03/03 17:59
2F：推 qiet:有跑过胶?大小也是140bp? 03/03 18:08
3F：推 zoom8080:primer dimer? 有看过melting curve吗? 03/03 19:07
4F：→ popopig2000:跑胶的大小也是140 bp, melting curve也是完全重叠 03/03 19:47
5F：→ popopig2000:一样的位置 03/03 19:48
6F：→ popopig2000:全部的sample都只出现一条band且都在相同位置 03/03 19:49
7F：→ popopig2000:为了排除抽DNA污染,也有跟同学借DNA来跑, 也是有band! 03/03 19:50
8F：→ popopig2000:感谢1,2,3楼的回覆, 到底为什麽会这样啊? 03/03 19:52
9F：推 mesenchymal:连只有水的也有140 bp那条band吗?? 03/03 20:44
10F：→ solomo:重新设计 1.换位置 2.加长primer 3.提高primer等级 03/03 22:58
11F：→ solomo:也可能是整套实验器材污染 03/03 22:59
12F：→ Anvec:primer 被污染了? 03/03 23:38
13F：→ Ianthegood:也是正确size大概是污染吧 03/04 00:10
14F：→ popopig2000:全部的东西都有重配, primer是拿stock再稀释 03/04 13:09
15F：→ popopig2000:所以是stock污染吗? 03/04 13:10
16F：→ popopig2000:没错,只有水的也只有140的band! 03/04 13:11
17F：→ decyen:pipetman污染? 03/04 14:08
18F：→ mzac1b:所以要买新的primer 来测试吗 @@!! 03/04 14:57
19F：推 icome:污染了 所有的东西换新的 连pipetman都要清 03/04 16:39
20F：→ popopig2000:谢谢大家的意见, 我已经订了新的primer, 并且重新设计 03/05 22:09
21F：→ puec2:pipetman污染啦 03/07 15:03
22F：→ puec2:你改用filter tip试试看就知道了。 03/07 15:05