作者solicitousCB (CB)
看板Biotech
標題[求救] 得不到insert ....
時間Fri Mar 2 15:12:22 2012
老師要我做construct
insert的部分 我先跑PCR 然後拿2ul跑膠check 得到很亮的band
之後PCR產物(38ul)全下去跑膠(load了三個well)
切了120mg的膠去溶 加500ul的GEX buffer
最後用60ul的60度C水去elute
之後跑膠check 照膠結果亮度變得很普通
接著取42.5ul的elution 用XhoI 2.5ul去切 切完之後全下跑電泳
照膠結果 雖然滿淡的 不過用GeneSnap去看還滿清楚的 切膠機下則是勉強看的到
切膠時 膠有260mg 所以我分兩管elute 各加500ul GEX buffer 最後各用35ul水去elute
但是 我取5ul去check時 卻根本沒有東西 >.<
去測DNA濃度 竟然還是負的Orz
我切膠的過程 都是照protocol上走 不過 我發現elute時即使水下在膜中央
水滴還是會歪一邊= = 然後就沒有全都包覆到膜
就會懷疑那半邊的DNA有沒有下來
不知道大家有沒有經驗 能夠幫忙敝人改正錯誤 得到insert呢?
另外想問一下有沒有人的實驗室是用一種不用gel extraction
而是直接用吸起來的電泳槽? 不知道那個要多少錢呢?
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.235.109
1F：推 tsubasawolfy:切膠回收率有2/3就可以偷笑了 連做兩次就越來越低.. 03/02 15:50
2F：→ tsubasawolfy:RE完直接做purification 現在很多kit gel extration 03/02 15:51
3F：→ tsubasawolfy:跟purification都用同一組 去看一下protocol吧 03/02 15:52
4F：→ blence:有些gel extraction manual有寫,低於50ul水,elute效率更減 03/02 15:53
5F：→ solicitousCB:不過我的產品說明上面說15~30ul為佳耶QQ 03/02 16:15
6F：→ solicitousCB:請問purification和 gel extraction有啥不一樣嗎?QQ 03/02 16:16
7F：→ solicitousCB:我們實驗室兩個名詞好像指的都一樣的東西 03/02 16:16
8F：推 tsubasawolfy:purificationg是指PCR完或者RE完 直接加入binding bu 03/02 16:46
9F：→ tsubasawolfy:ff(每家廠商名稱都不一樣)混合均勻後過spin column 03/02 16:47
10F：→ tsubasawolfy:->wash->elute 可以拿到濃度較高的sample, insert部 03/02 16:48
11F：→ tsubasawolfy:分用RE切下來的bp少 用跑膠分不出哪些沒切哪些有切 03/02 16:48
12F：→ tsubasawolfy:而且量又不像vector可以一次大量取 所以vector 部分 03/02 16:49
13F：→ tsubasawolfy:RE完會做切膠純化 insert部分就直接純化 03/02 16:49
14F：→ rasaze:我也是一直碰到差不多的問題，elution後濃度低到誇張 03/02 17:24
15F：→ solicitousCB:我們實驗室有Gene-Spin這產品 請問是purification嗎? 03/02 18:05
16F：→ icome:insert別做gel extration 我已經發生很多次慘案... 03/02 23:11
17F：→ icome:尤其越短的回收率越低... 03/02 23:11
18F：→ icome:其實你的東西還在 只是低到用膠看不到 03/02 23:13
19F：→ qumai:不要跑膠直接回收吧 03/04 16:03
20F：→ Ice9:不要在R.E.作用前做膠回收，會切不好。 03/20 11:57