作者solicitousCB (CB)
看板Biotech
标题[求救] 得不到insert ....
时间Fri Mar 2 15:12:22 2012
老师要我做construct
insert的部分 我先跑PCR 然後拿2ul跑胶check 得到很亮的band
之後PCR产物(38ul)全下去跑胶(load了三个well)
切了120mg的胶去溶 加500ul的GEX buffer
最後用60ul的60度C水去elute
之後跑胶check 照胶结果亮度变得很普通
接着取42.5ul的elution 用XhoI 2.5ul去切 切完之後全下跑电泳
照胶结果 虽然满淡的 不过用GeneSnap去看还满清楚的 切胶机下则是勉强看的到
切胶时 胶有260mg 所以我分两管elute 各加500ul GEX buffer 最後各用35ul水去elute
但是 我取5ul去check时 却根本没有东西 >.<
去测DNA浓度 竟然还是负的Orz
我切胶的过程 都是照protocol上走 不过 我发现elute时即使水下在膜中央
水滴还是会歪一边= = 然後就没有全都包覆到膜
就会怀疑那半边的DNA有没有下来
不知道大家有没有经验 能够帮忙敝人改正错误 得到insert呢?
另外想问一下有没有人的实验室是用一种不用gel extraction
而是直接用吸起来的电泳槽? 不知道那个要多少钱呢?
谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.235.109
1F：推 tsubasawolfy:切胶回收率有2/3就可以偷笑了 连做两次就越来越低.. 03/02 15:50
2F：→ tsubasawolfy:RE完直接做purification 现在很多kit gel extration 03/02 15:51
3F：→ tsubasawolfy:跟purification都用同一组 去看一下protocol吧 03/02 15:52
4F：→ blence:有些gel extraction manual有写,低於50ul水,elute效率更减 03/02 15:53
5F：→ solicitousCB:不过我的产品说明上面说15~30ul为佳耶QQ 03/02 16:15
6F：→ solicitousCB:请问purification和 gel extraction有啥不一样吗?QQ 03/02 16:16
7F：→ solicitousCB:我们实验室两个名词好像指的都一样的东西 03/02 16:16
8F：推 tsubasawolfy:purificationg是指PCR完或者RE完 直接加入binding bu 03/02 16:46
9F：→ tsubasawolfy:ff(每家厂商名称都不一样)混合均匀後过spin column 03/02 16:47
10F：→ tsubasawolfy:->wash->elute 可以拿到浓度较高的sample, insert部 03/02 16:48
11F：→ tsubasawolfy:分用RE切下来的bp少 用跑胶分不出哪些没切哪些有切 03/02 16:48
12F：→ tsubasawolfy:而且量又不像vector可以一次大量取 所以vector 部分 03/02 16:49
13F：→ tsubasawolfy:RE完会做切胶纯化 insert部分就直接纯化 03/02 16:49
14F：→ rasaze:我也是一直碰到差不多的问题，elution後浓度低到夸张 03/02 17:24
15F：→ solicitousCB:我们实验室有Gene-Spin这产品 请问是purification吗? 03/02 18:05
16F：→ icome:insert别做gel extration 我已经发生很多次惨案... 03/02 23:11
17F：→ icome:尤其越短的回收率越低... 03/02 23:11
18F：→ icome:其实你的东西还在 只是低到用胶看不到 03/02 23:13
19F：→ qumai:不要跑胶直接回收吧 03/04 16:03
20F：→ Ice9:不要在R.E.作用前做胶回收，会切不好。 03/20 11:57