作者lier1986 (紫)
看板Biotech
標題[求救] 質體轉不進表現菌株~請問有什麼辦法解決
時間Wed Feb 29 15:28:09 2012
小弟我在幾個星期前有發一篇相關的文
許多版友都認為可能是我insert DNA對細菌有致死性
所以我對實驗做了兩個部分的修改
應該可以證明 並不是上述原因
第一 我用的expression host 改成用BL21(DE3)pLysS
在有IPTG誘導的情況下 insert DNA才會表現
但是 轉型後還是不長菌
第二 我將做完電穿孔的菌液 分成兩半 塗在含有不同抗生素的盤子中
BL21(DE3)pLysS自己帶有抗chloramphenicol的基因
所以長在chloramphenicol的盤子上 非常良好
但 對應plasmid的抗抗生素基因的盤子 則是一個也長不出來
表示 我的plasmid根本沒有轉進去
我用的質體是pET20b 大小是3.7K左右
加上insert DNA之後 大小約為5.5K
將pET20b轉入BL21(DE3)pLysS
只要用3ng就長很多 (此為control 代表我的competent cell是可以用的 雖然效率差了點)
但是加上insert DNA的pET20b怎麼樣都長不出來 (應該說 轉不進去
請問大家有類似的經驗嗎? 該怎麼解決呢?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.122.198.84
1F：推 nhxcyge:你有確認過vector的sequence沒有錯誤嗎？ 會不會是接上 02/29 16:39
2F：→ nhxcyge:insert的vector序列有錯，以致無法抗chloroamphenical 02/29 16:40
3F：→ blence:樓上誤解，原po應該是說無法抗plasmid上的Amp 02/29 17:31
4F：→ lier1986:blence沒錯 02/29 17:35
5F：推 TAKONA:那會不會是insert沒帶stop codon做出奇怪的東西阿？ 02/29 19:46
6F：→ TAKONA:做不出你的目標蛋白和amp之類的 02/29 19:47
7F：→ Ianthegood:ampR是獨立的gene阿 02/29 22:40
8F：推 lyu0001:理論上DH5alpha也是可以表現出蛋白質... 02/29 22:51
9F：推 tsubasawolfy:電不進去就是是傳統的heat shock吧 如果heat shock 03/01 13:40
10F：→ tsubasawolfy:可以進去那就回頭檢討電的過程是那邊造成差異 03/01 13:40
11F：→ lier1986:stop codon是在plasmid上 也沒有被限制酵素切掉 03/01 16:15
12F：→ lier1986:所以應該不是這個問題 03/01 16:15
13F：→ lier1986:我在想是不是因為質體大小的差異影響到轉型效率 03/01 16:17
14F：→ lyu0001:電穿孔後，加LB medium 37degree 1hr試試看 03/01 17:12
15F：推 micocat:我覺得你的二個修改並不能證明insert DNA對細菌沒有致死性 03/02 11:09
16F：→ micocat:如果同時transform到BL21跟DH5alpha(or XL-blue?) 03/02 11:11
17F：→ micocat:就可以確認是不是表現的蛋白有毒性了 03/02 11:12
18F：推 Fourfish:DH5a轉的進去嗎? ligation後直接轉BL21效果通常很差 03/02 20:49
19F：→ Fourfish:先轉進DH5a再抽plasmid 再轉BL21試試看吧 03/02 20:49
20F：推 icome:試試樓上說的 而且你也不確定是不是ligation出問題 03/02 23:10
21F：→ blence:真是鬼打牆,原po文提過是將XL-blue長好的plasmid送到BL21卻 03/02 23:47
22F：→ blence:長不起來,如何懷疑這樣re-transform會跟ligation有關 03/02 23:49
23F：推 dennisyoung7:掐指一算 原PO是第八個月了嗎 QQ 03/04 00:07
24F：→ dennisyoung7:electroporation後先用LB在37C長 30~60min 03/04 00:08
25F：→ dennisyoung7:然後離心除去大部分上清液後plate全部的細胞 03/04 00:11
26F：→ dennisyoung7:或許有機會提高效率 03/04 00:13
27F：→ dennisyoung7:我會想拿些plasmid跑電泳,看size跟量 03/04 00:14
28F：→ lier1986:樓上大大...時間我已經不記得了TAT... 03/05 12:48
29F：→ lier1986:電完之後 放在37度LB培養一小時 這個動作我有做 03/05 12:49
30F：→ lier1986:但是離心取pellet倒是沒試過 但我是有把所有的菌液都塗 03/05 12:51
31F：→ lier1986:盤 03/05 12:53
32F：→ lier1986:plasmid 的大小跟insert DNA的大小都跑過電泳確認了 03/05 12:54
33F：→ lier1986:從XL1-blue抽出來plasmid的量也用nano drop測過 03/05 12:55
34F：→ lier1986:抽出來的plasmid濃度最高到122ng/uL 應該是沒問題的 03/05 12:59
35F：→ lier1986:這幾天又做了別的實驗 如同micocat所說 03/05 13:02
36F：→ lier1986:將plasmid轉到XL1-blue和BL21(DE3)pLysS中 03/05 13:04
37F：→ lier1986:轉到XL1-blue長了很多 但轉到BL21(DE3)pLysS就不長 03/05 13:04
38F：→ lier1986:但這個結果我覺得不能證明我的蛋白有致死性 03/05 13:05
39F：→ lier1986:因為如同我文中所講 pLysS是會抑制insert DNA表現的 03/05 13:06
40F：→ lier1986:我的盤子上只有抗生素 沒有IPTG 基本上重組蛋白是不會表 03/05 13:07
41F：→ lier1986:現的 03/05 13:07
42F：→ lier1986:反而更讓我覺得 應該是有什麼原因 使得plasmid轉不進去 03/05 13:07
43F：推 dennisyoung7:但是單獨pET20b轉入BL21(DE3)pLysS就會長... 03/05 20:23
44F：推 dennisyoung7:印象中我用的vector好像有6k bps 也是很好轉囧> 03/05 20:34
45F：→ lier1986:嗯 我自己做也是這樣 轉pET20b很簡單 03/06 15:23
46F：→ lier1986:但是 有insert的轉了就是不會長 03/06 15:23