作者lier1986 (紫)
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标题[求救] 质体转不进表现菌株~请问有什麽办法解决
时间Wed Feb 29 15:28:09 2012
小弟我在几个星期前有发一篇相关的文
许多版友都认为可能是我insert DNA对细菌有致死性
所以我对实验做了两个部分的修改
应该可以证明 并不是上述原因
第一 我用的expression host 改成用BL21(DE3)pLysS
在有IPTG诱导的情况下 insert DNA才会表现
但是 转型後还是不长菌
第二 我将做完电穿孔的菌液 分成两半 涂在含有不同抗生素的盘子中
BL21(DE3)pLysS自己带有抗chloramphenicol的基因
所以长在chloramphenicol的盘子上 非常良好
但 对应plasmid的抗抗生素基因的盘子 则是一个也长不出来
表示 我的plasmid根本没有转进去
我用的质体是pET20b 大小是3.7K左右
加上insert DNA之後 大小约为5.5K
将pET20b转入BL21(DE3)pLysS
只要用3ng就长很多 (此为control 代表我的competent cell是可以用的 虽然效率差了点)
但是加上insert DNA的pET20b怎麽样都长不出来 (应该说 转不进去
请问大家有类似的经验吗? 该怎麽解决呢?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.122.198.84
1F：推 nhxcyge:你有确认过vector的sequence没有错误吗？ 会不会是接上 02/29 16:39
2F：→ nhxcyge:insert的vector序列有错，以致无法抗chloroamphenical 02/29 16:40
3F：→ blence:楼上误解，原po应该是说无法抗plasmid上的Amp 02/29 17:31
4F：→ lier1986:blence没错 02/29 17:35
5F：推 TAKONA:那会不会是insert没带stop codon做出奇怪的东西阿？ 02/29 19:46
6F：→ TAKONA:做不出你的目标蛋白和amp之类的 02/29 19:47
7F：→ Ianthegood:ampR是独立的gene阿 02/29 22:40
8F：推 lyu0001:理论上DH5alpha也是可以表现出蛋白质... 02/29 22:51
9F：推 tsubasawolfy:电不进去就是是传统的heat shock吧 如果heat shock 03/01 13:40
10F：→ tsubasawolfy:可以进去那就回头检讨电的过程是那边造成差异 03/01 13:40
11F：→ lier1986:stop codon是在plasmid上 也没有被限制酵素切掉 03/01 16:15
12F：→ lier1986:所以应该不是这个问题 03/01 16:15
13F：→ lier1986:我在想是不是因为质体大小的差异影响到转型效率 03/01 16:17
14F：→ lyu0001:电穿孔後，加LB medium 37degree 1hr试试看 03/01 17:12
15F：推 micocat:我觉得你的二个修改并不能证明insert DNA对细菌没有致死性 03/02 11:09
16F：→ micocat:如果同时transform到BL21跟DH5alpha(or XL-blue?) 03/02 11:11
17F：→ micocat:就可以确认是不是表现的蛋白有毒性了 03/02 11:12
18F：推 Fourfish:DH5a转的进去吗? ligation後直接转BL21效果通常很差 03/02 20:49
19F：→ Fourfish:先转进DH5a再抽plasmid 再转BL21试试看吧 03/02 20:49
20F：推 icome:试试楼上说的 而且你也不确定是不是ligation出问题 03/02 23:10
21F：→ blence:真是鬼打墙,原po文提过是将XL-blue长好的plasmid送到BL21却 03/02 23:47
22F：→ blence:长不起来,如何怀疑这样re-transform会跟ligation有关 03/02 23:49
23F：推 dennisyoung7:掐指一算 原PO是第八个月了吗 QQ 03/04 00:07
24F：→ dennisyoung7:electroporation後先用LB在37C长 30~60min 03/04 00:08
25F：→ dennisyoung7:然後离心除去大部分上清液後plate全部的细胞 03/04 00:11
26F：→ dennisyoung7:或许有机会提高效率 03/04 00:13
27F：→ dennisyoung7:我会想拿些plasmid跑电泳,看size跟量 03/04 00:14
28F：→ lier1986:楼上大大...时间我已经不记得了TAT... 03/05 12:48
29F：→ lier1986:电完之後 放在37度LB培养一小时 这个动作我有做 03/05 12:49
30F：→ lier1986:但是离心取pellet倒是没试过 但我是有把所有的菌液都涂 03/05 12:51
31F：→ lier1986:盘 03/05 12:53
32F：→ lier1986:plasmid 的大小跟insert DNA的大小都跑过电泳确认了 03/05 12:54
33F：→ lier1986:从XL1-blue抽出来plasmid的量也用nano drop测过 03/05 12:55
34F：→ lier1986:抽出来的plasmid浓度最高到122ng/uL 应该是没问题的 03/05 12:59
35F：→ lier1986:这几天又做了别的实验 如同micocat所说 03/05 13:02
36F：→ lier1986:将plasmid转到XL1-blue和BL21(DE3)pLysS中 03/05 13:04
37F：→ lier1986:转到XL1-blue长了很多 但转到BL21(DE3)pLysS就不长 03/05 13:04
38F：→ lier1986:但这个结果我觉得不能证明我的蛋白有致死性 03/05 13:05
39F：→ lier1986:因为如同我文中所讲 pLysS是会抑制insert DNA表现的 03/05 13:06
40F：→ lier1986:我的盘子上只有抗生素 没有IPTG 基本上重组蛋白是不会表 03/05 13:07
41F：→ lier1986:现的 03/05 13:07
42F：→ lier1986:反而更让我觉得 应该是有什麽原因 使得plasmid转不进去 03/05 13:07
43F：推 dennisyoung7:但是单独pET20b转入BL21(DE3)pLysS就会长... 03/05 20:23
44F：推 dennisyoung7:印象中我用的vector好像有6k bps 也是很好转囧> 03/05 20:34
45F：→ lier1986:嗯 我自己做也是这样 转pET20b很简单 03/06 15:23
46F：→ lier1986:但是 有insert的转了就是不会长 03/06 15:23