作者begrace ()
看板Biotech
標題[求救] 中研院shRNA transfect至細胞中
時間Tue Feb 28 21:45:09 2012
大家好，最近我在中研院訂了兩株基因的shRNA菌液 (為pLKO.1 vector)
自己用TB養大量抽取以後，老師教我先試試看直接transient transfect至293細胞中
目的是想確認這兩組shRNA是否真的在細胞中有作用
奇怪的是完全都沒有knock down
在這之前我都確認了
1. shRNA已定序過，的確是辨認我想要的基因
2. 大量DNA用phenol/chloroform沉澱過，有跑膠且測定OD260/280為1.6-1.7
3. 抗體已確認過可用，我曾經外加表現此基因至293細胞，major band有增加的現象
4. 我確認自己trasfection的技術沒問題，還請其他人幫忙做過，也無 K.D.的反應
我在中研院訂這兩組shRNA時，它還有feedback表示兩組的K.D.效率都有70%
不知道版上有沒有人曾經拿過中研院的shRNA轉染到細胞有K.D.成功的，想請教心得
感謝~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 125.232.26.135
1F：推 TAKONA:沒有selection嗎？ 02/28 21:48
2F：→ begrace:沒有耶，因為只是暫時性表現而已 02/28 21:49
3F：推 icome:transient transfection效果都很差 做成病毒才真正有效果 02/28 22:20
4F：→ icome:不知道為啥 中研院這系統很tricky 02/28 22:21
5F：推 icome:篩成stable會有效 但會比病毒感染差 02/28 22:23
6F：→ icome:還有feedback只能參考 自己做常常都不會到那個效率... 02/28 22:25
7F：→ begrace:謝謝樓上! 02/28 23:25
8F：→ begrace:我再試試看其他組，或著直接做lenti virus試試 02/28 23:25
9F：推 liuse:它每個gene應該都有至少五組plasmid 02/29 02:49
10F：→ liuse:建議全部買來試 02/29 02:50
11F：→ liuse:另外用lentivirus效果真的才會好 不然就用puro篩吧 02/29 02:51
12F：推 dragonjaff:transient transfection +puro 細胞會死一大票 02/29 03:20
13F：→ dragonjaff:等篩成stable又要一段時間 建議你還是直接包lentivirus 02/29 03:21
14F：→ dragonjaff:原po的狀況跟我一樣 相信我 不要試了 直接包病毒最快 02/29 03:23
15F：推 liuse:不用篩stable阿 把存活的收下來壓western就好了 02/29 04:42
16F：推 Realthugz:transient效果難拿捏 KD效果每個clone都有差 02/29 20:03
17F：→ begrace:今天跟老師討論，他提到實驗室之前也有人訂過中研院的 02/29 23:06
18F：→ begrace:shRNA，並強調之前的人有用transient的方法做成功過.... 02/29 23:09
19F：→ begrace:謝謝各位的意見，我會再試試 02/29 23:13
20F：→ blood321:我是用Nucleofector 去轉染 effiency還頗高! 03/01 09:50
21F：推 puec2:嘖嘖 還有人在跟中研院的shRNA奮戰 03/01 12:52
22F：→ puec2:用RNAi比較快啦 03/01 12:52
23F：→ sancra:transient要注意protein half life的問題(之前被陰很久) 03/01 20:45
24F：→ begrace:@@ 樓上上是指中研院的shRNA不好做嘛? 另外protein half 03/01 21:40
25F：→ begrace:life是指要先確認這個蛋白質在細胞內會表現多久嘛? 03/01 21:41
26F：→ sancra:因為shRNA是degrade mRNA，所以新的protein不會做出來 03/02 09:17
27F：→ sancra:但舊的protein還會在，那舊的protein要多久會自然被degrade 03/02 09:18
28F：→ sancra:掉，你可能要查一下，因為transient進去的shRNA效用也不久 03/02 09:19
29F：推 leoblack:樓上good point!!! 03/02 14:31
30F：推 Realthugz:就是sancra說的那樣 才會做virus比較好... 03/02 15:38
31F：→ Realthugz:transient的window其實可以很小 被你觀察到是賺到... 03/02 15:40
32F：→ begrace:瞭解，謝謝大家給的資訊:) 03/02 22:40
33F：推 puec2:如果不是需要stable clone, siRNA比較快啦。真的。 03/07 15:11