作者begrace ()
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标题[求救] 中研院shRNA transfect至细胞中
时间Tue Feb 28 21:45:09 2012
大家好，最近我在中研院订了两株基因的shRNA菌液 (为pLKO.1 vector)
自己用TB养大量抽取以後，老师教我先试试看直接transient transfect至293细胞中
目的是想确认这两组shRNA是否真的在细胞中有作用
奇怪的是完全都没有knock down
在这之前我都确认了
1. shRNA已定序过，的确是辨认我想要的基因
2. 大量DNA用phenol/chloroform沉淀过，有跑胶且测定OD260/280为1.6-1.7
3. 抗体已确认过可用，我曾经外加表现此基因至293细胞，major band有增加的现象
4. 我确认自己trasfection的技术没问题，还请其他人帮忙做过，也无 K.D.的反应
我在中研院订这两组shRNA时，它还有feedback表示两组的K.D.效率都有70%
不知道版上有没有人曾经拿过中研院的shRNA转染到细胞有K.D.成功的，想请教心得
感谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 125.232.26.135
1F：推 TAKONA:没有selection吗？ 02/28 21:48
2F：→ begrace:没有耶，因为只是暂时性表现而已 02/28 21:49
3F：推 icome:transient transfection效果都很差 做成病毒才真正有效果 02/28 22:20
4F：→ icome:不知道为啥 中研院这系统很tricky 02/28 22:21
5F：推 icome:筛成stable会有效 但会比病毒感染差 02/28 22:23
6F：→ icome:还有feedback只能参考 自己做常常都不会到那个效率... 02/28 22:25
7F：→ begrace:谢谢楼上! 02/28 23:25
8F：→ begrace:我再试试看其他组，或着直接做lenti virus试试 02/28 23:25
9F：推 liuse:它每个gene应该都有至少五组plasmid 02/29 02:49
10F：→ liuse:建议全部买来试 02/29 02:50
11F：→ liuse:另外用lentivirus效果真的才会好 不然就用puro筛吧 02/29 02:51
12F：推 dragonjaff:transient transfection +puro 细胞会死一大票 02/29 03:20
13F：→ dragonjaff:等筛成stable又要一段时间 建议你还是直接包lentivirus 02/29 03:21
14F：→ dragonjaff:原po的状况跟我一样 相信我 不要试了 直接包病毒最快 02/29 03:23
15F：推 liuse:不用筛stable阿 把存活的收下来压western就好了 02/29 04:42
16F：推 Realthugz:transient效果难拿捏 KD效果每个clone都有差 02/29 20:03
17F：→ begrace:今天跟老师讨论，他提到实验室之前也有人订过中研院的 02/29 23:06
18F：→ begrace:shRNA，并强调之前的人有用transient的方法做成功过.... 02/29 23:09
19F：→ begrace:谢谢各位的意见，我会再试试 02/29 23:13
20F：→ blood321:我是用Nucleofector 去转染 effiency还颇高! 03/01 09:50
21F：推 puec2:啧啧 还有人在跟中研院的shRNA奋战 03/01 12:52
22F：→ puec2:用RNAi比较快啦 03/01 12:52
23F：→ sancra:transient要注意protein half life的问题(之前被阴很久) 03/01 20:45
24F：→ begrace:@@ 楼上上是指中研院的shRNA不好做嘛? 另外protein half 03/01 21:40
25F：→ begrace:life是指要先确认这个蛋白质在细胞内会表现多久嘛? 03/01 21:41
26F：→ sancra:因为shRNA是degrade mRNA，所以新的protein不会做出来 03/02 09:17
27F：→ sancra:但旧的protein还会在，那旧的protein要多久会自然被degrade 03/02 09:18
28F：→ sancra:掉，你可能要查一下，因为transient进去的shRNA效用也不久 03/02 09:19
29F：推 leoblack:楼上good point!!! 03/02 14:31
30F：推 Realthugz:就是sancra说的那样 才会做virus比较好... 03/02 15:38
31F：→ Realthugz:transient的window其实可以很小 被你观察到是赚到... 03/02 15:40
32F：→ begrace:了解，谢谢大家给的资讯:) 03/02 22:40
33F：推 puec2:如果不是需要stable clone, siRNA比较快啦。真的。 03/07 15:11