作者gqqueen (夠幸福了)
看板Biotech
標題[求救] 跑PI時出現奇怪的圖形(已解決)
時間Tue Feb 28 02:13:14 2012
今天跑PI時，如往常般的處理細胞(70%酒精 over night)及染色，
以往在DMSO control皆會有G1.S.G2/M明顯的peak，但今天要在重複實驗時，
卻在FL2A-counts圖只出現一個山丘狀的圖形也很不sharp，完全沒有其他的Peak產生
而在FSC/SSC圖細胞也不是均勻散布，反而有點橢圓形緻密，然後在FL2-A/FL2-W
也沒出現正常的圖形，反而是一條長長的細胞帶狀圖，調了很多次數值也一樣，
叫出以前同樣細胞同樣處理的condition也是找不出問題
想請教版上的專家，有在跑PI時碰過類似的情況嗎？
細胞的處理:藥物處理 24 48 72小時
Control:DMSO
細胞打下來前都有先觀察，和先前的實驗差不多，這是reapeat實驗
先謝謝大家的幫忙了
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◆ From: 122.117.13.40
※ 編輯: gqqueen 來自: 122.117.13.40 (02/28 02:20)
1F：推 FireHell:參數跑掉了 02/28 02:34
2F：→ gqqueen:可以請F大再詳細說明嗎 不懂參數跑掉指哪一個? 02/28 02:45
3F：推 FireHell:FSC, SSC, FL2, FL2-A, FL2-W這些參數的Voltage和amp 02/29 13:06
4F：→ FireHell:要調一下 02/29 13:06
5F：→ FireHell:另外橢圓形和帶狀都是正常的耶 02/29 13:08
6F：推 qiet:flow cytometry有受過什麼調整過嗎? 02/29 19:31
7F：→ qiet:有的話參數要重抓 但如果機器都正常...可能要想別的原因 02/29 19:32
8F：→ gqqueen:隔天我有先拿別株細胞測試是不是reagent出問題，跑完之後 02/29 22:17
9F：→ gqqueen:都是對的，所以我馬上拿我有問題的sample從新跑一遍， 02/29 22:17
10F：→ gqqueen:最後發現出現peak怪怪的只有在48.72小時，而24小時的都很 02/29 22:18
11F：→ gqqueen:正常，所以目前把問題縮小到48,72小時細胞前處理哪個環節 02/29 22:19
12F：→ gqqueen:但原因現在還不清楚，我唯一想的到的可能，是細胞收下來後 02/29 22:20
13F：→ gqqueen:放在室溫一個小時，不知道是不是這樣的因素 導致MDA-MB-23 02/29 22:21
14F：→ gqqueen:細胞出問題，才會跑出奇怪的圖形，不知道大家覺得這樣 02/29 22:22
15F：→ gqqueen:的解釋合理嗎？這是排除人為操作，reagent，flow熟練度 02/29 22:22
16F：→ gqqueen:唯一的可能解釋了，因為這個實驗我repeat兩次都沒問題 02/29 22:23
17F：→ gqqueen:就在最後一次出了問題了@@" 02/29 22:24
18F：推 qiet:細胞收下來後固定前我都會放在冰上or4度C 避免細胞產生奇怪的 03/01 01:14
19F：→ qiet:變化 03/01 01:15
20F：推 lyu0001:可能是同一批細胞固定染色不完全 03/01 10:25
21F：→ FireHell:不同時間點的FSC和SSC可以參數不同，GATING範圍不同 03/01 14:15
22F：→ FireHell:看起來比較像是細胞型態在48H後劇烈變化而沒有GATING好 03/01 14:16
23F：→ FireHell:另外一個可能就是你的TREAT會導致S phase arrest 03/01 14:17
24F：→ gqqueen:給Qiet 我48.72小時細胞收下來後，就擺在架子上，大約一小 03/01 20:08
25F：→ gqqueen:時以上= = 當時後再做另一個實驗，所以就沒先處理了，下次 03/01 20:08
26F：→ gqqueen:我會先放在冰上看看 03/01 20:09
27F：→ gqqueen:給F大我跑PI只有gateingFL2-A/FL2-W這邊，然後我發現48小 03/01 20:10
28F：→ gqqueen:時候的細胞，在FSC/SSC這邊有幾管出現疑似兩群不同大小的 03/01 20:12
29F：→ gqqueen:的細胞，但他們還是有重疊，形狀類似於兔子的耳朵但有交疊 03/01 20:12
30F：→ gqqueen:不知道這樣形容貼不貼切 03/01 20:13
31F：→ gqqueen:48小時以後的細胞 03/01 20:13
32F：→ gqqueen:給L大我細胞都固定至少24小時，然後染色也有兩個小時以上 03/01 20:14
33F：→ gqqueen:避光保存，這樣還會發生染色固定不完全嗎? 03/01 20:15
34F：推 FireHell:收細胞要快，所以放1h絕對不ok，不過會不會導致這些結果 03/02 15:12
35F：→ FireHell:不得而知，建議下次收細胞要連續之外，可參照這篇 03/02 15:12
37F：→ FireHell:另外注意流速控制在LOW SPEED 100 EVENTS/SEC 03/02 15:15
38F：→ gqqueen:謝謝F大提供這個很棒的資料，可以把參數條得更好，非常謝 03/02 22:18
39F：→ gqqueen:謝你，這次重做我不敢再放那麼久了，本來以為不會出什麼 03/02 22:18
40F：→ gqqueen:什麼問題，看來下次收下來前一定要先放冰上，盡快固定 03/02 22:19
※ 編輯: gqqueen 來自: 122.117.13.40 (03/02 22:19)
※ 編輯: gqqueen 來自: 122.117.13.40 (03/02 22:20)