作者homfans (homfans)
看板Biotech
標題[求救] 藻藍蛋白純化
時間Fri Feb 17 00:55:29 2012
最近實驗要從微藻中萃取藻藍素(藻藍蛋白)
由於本身不是念生科相關科系,所以有很多paper的方法有看沒有懂
目前實驗只進行到粗萃部份
將藻粉溶於0.05M的Sodium phosphate buffer,經過三次的冷凍解凍打破細胞後
離心後取藍色上清液,到這裡是粗萃
接下來要純化藻藍素,paper上有寫到是用50%的硫酸銨進行沉澱
沉澱後經離心取藍色沉澱物,接著溶於小體積的5mM Na-phosphate buffer中
到這邊為止是看得懂但還沒去操作的
Q1:如何配置飽和硫酸銨溶液?
我是將400g的硫酸銨加入500mL的水中,加熱到60度溶解,趁熱過濾掉沉澱
接著放在室溫下平衡,這樣是否有錯??
paper繼續寫到關於透析的部份,這部分就是我目前最頭大的部分
原文如下:
The dialysed PC was then placed in a 2.5 cm X 25 cm hydroxyapatite column
(Bio-Rad Laboratories, CA, USA) and fractions were eluted
with Na-phosphate buffer pH 7.0 of increasing ionic strength
(from 5 to 150 mM). The fractions showing an absorbance ratio
of 620 nm/280 nm greater than four were pooled and brought to
saturation with ammonium sulfate.
Q2:hydroxyapatite column 要如何使用??
是買來就是像HPLC的column一樣,還是要自己裝填
又或者是他可以裝在HPLC上??
Q3:increasing ionic strength from 5 to 150 mM 要如何操作??
如果hydroxyapatite column是可以裝在HPLC上的話,這個就不難解決
但如果不是的話,我就不知道該使用什麼了
Q4:蛋白質經過硫酸銨沉澱後一定要透析嗎??如果不透析,可以直接打HPLC??
這是最重要的一件事了,如果可以不透析,就可以省去很多花費
但就是不知道會不會傷到column(C4 column)與對實驗造成誤差
感謝大家看完我落落長的問題,懇請大家幫幫迷惑無助的我
感謝!!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.33.233.10
1F：推 legendhero:用as和HPLC，還不如用直接FPLC純化 02/18 05:13
2F：推 missal:你去看一下amonium precipitation的做法 02/18 12:38
3F：→ missal:你看你要純化的含藍藻素的溶液總共有多少體積 02/18 12:39
4F：→ missal:對應這個體積加上50% 飽和ammonium sulfate所需要的量 02/18 12:40
5F：→ missal:要加多少protocol裡面都有換算表 02/18 12:40
6F：推 missal:Current Protocols in Protein Science裡面有詳細做法 02/18 12:43
8F：→ vetvet:ammonium sulfate percipitation請參考 02/19 02:19