作者lier1986 (紫)
看板Biotech
標題[求救] 將建構好的質體放入expression host
時間Wed Feb 15 18:37:26 2012
小弟現在碰到一個很奇怪的問題
就如同標題所說
我將建構好的質體(pET20b + insert DNA)用電穿孔的方式放入BL21(DE3)
但是做了三次都沒成功 而且質體使用的量是一次比一次多
第一次用3ng 第二次用15ng 第三次用30ng
我回頭去測試competent cell是不是有問題
所以使用沒有insert DNA的pET20b
結果使用3ng的pET20b就長了整盤
請問有人碰過這樣的狀況嗎
該怎麼解決呢?
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◆ From: 140.122.198.162
1F：推 twcitizen:insertin seq的方向性是否正確？用RE切切看 02/15 19:48
2F：推 aggaci:沒成功是指沒表現?還是沒長colony? 02/15 23:00
3F：推 aggaci:若是沒長...我覺的是你表現的protein有毒性 02/15 23:02
4F：推 Realthugz:ng?? 希望你只是筆誤 02/16 16:54
5F：→ blence:樓上覺得ng哪裡奇怪? 02/16 18:18
6F：推 jasmineapple:transform的方式有很多種 也不一定要用電穿孔阿 02/16 18:18
7F：推 jasmineapple:依據你的說法competent cell是沒有問題的 我覺得要 02/16 18:23
8F：→ jasmineapple:不要檢查你的序列 還有insert以及vector對應的enzym 02/16 18:26
9F：→ jasmineapple:e或是去看看序列當中是否有你enzyme的切位 有時候 02/16 18:27
10F：→ jasmineapple:primer也有可能不小心設計錯喔~因為我就有過這樣的 02/16 18:27
11F：→ jasmineapple:教訓 02/16 18:28
12F：→ lier1986:insert的方向應該是沒有問題的 我是用兩個不同的RE切的 02/17 12:29
13F：→ lier1986:沒成功是指沒長colony沒錯 我也覺得可能是protein有毒 02/17 12:30
14F：→ lier1986:但是我使用了BL21(DE3)pLysS當host 但還是得到一樣的結果 02/17 12:30
15F：→ lier1986:使用沒有insert的pET20b當control就有長菌 02/17 12:31
16F：→ lier1986:有insert的pET20b就沒長菌 02/17 12:32
17F：→ lier1986:ng單位是沒寫錯的 一般我看到的protocol也是用ng 02/17 12:33
18F：→ lier1986:我的經驗也是 只要使用1ng的plasimd就可以長整盤的菌 02/17 12:34
19F：→ lier1986:使用電穿孔的方式是因為實驗室大部分都是用這種方法 02/17 12:35
20F：→ lier1986:序列檢查的部分我確實還沒做 我們老闆是覺得能夠表現重組 02/17 12:38
21F：→ lier1986:蛋白之後再去確定序列是否正確 02/17 12:39
22F：→ lier1986:我想不通的地方是 明明plasmid是從XL1-blue裡抽出的 02/17 12:41
23F：→ lier1986:但放到BL21(DE3)卻沒辦法長 我一開始一直以為是vector 02/17 12:42
24F：→ lier1986:上的antibiotic gene壞掉 但應該不是 02/17 12:43
25F：推 bluecsky:可能你的蛋白有毒 promoter又關不緊 可以嘗試在培養基中 02/18 09:06
26F：→ bluecsky:加入抑制promoter表現的東西 或是換一下培養的溫度 02/18 09:07
27F：→ bluecsky:降低他的表現量或許就會長出來了 02/18 09:07