作者lier1986 (紫)
看板Biotech
标题[求救] 将建构好的质体放入expression host
时间Wed Feb 15 18:37:26 2012
小弟现在碰到一个很奇怪的问题
就如同标题所说
我将建构好的质体(pET20b + insert DNA)用电穿孔的方式放入BL21(DE3)
但是做了三次都没成功 而且质体使用的量是一次比一次多
第一次用3ng 第二次用15ng 第三次用30ng
我回头去测试competent cell是不是有问题
所以使用没有insert DNA的pET20b
结果使用3ng的pET20b就长了整盘
请问有人碰过这样的状况吗
该怎麽解决呢?
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.122.198.162
1F：推 twcitizen:insertin seq的方向性是否正确？用RE切切看 02/15 19:48
2F：推 aggaci:没成功是指没表现?还是没长colony? 02/15 23:00
3F：推 aggaci:若是没长...我觉的是你表现的protein有毒性 02/15 23:02
4F：推 Realthugz:ng?? 希望你只是笔误 02/16 16:54
5F：→ blence:楼上觉得ng哪里奇怪? 02/16 18:18
6F：推 jasmineapple:transform的方式有很多种 也不一定要用电穿孔阿 02/16 18:18
7F：推 jasmineapple:依据你的说法competent cell是没有问题的 我觉得要 02/16 18:23
8F：→ jasmineapple:不要检查你的序列 还有insert以及vector对应的enzym 02/16 18:26
9F：→ jasmineapple:e或是去看看序列当中是否有你enzyme的切位 有时候 02/16 18:27
10F：→ jasmineapple:primer也有可能不小心设计错喔~因为我就有过这样的 02/16 18:27
11F：→ jasmineapple:教训 02/16 18:28
12F：→ lier1986:insert的方向应该是没有问题的 我是用两个不同的RE切的 02/17 12:29
13F：→ lier1986:没成功是指没长colony没错 我也觉得可能是protein有毒 02/17 12:30
14F：→ lier1986:但是我使用了BL21(DE3)pLysS当host 但还是得到一样的结果 02/17 12:30
15F：→ lier1986:使用没有insert的pET20b当control就有长菌 02/17 12:31
16F：→ lier1986:有insert的pET20b就没长菌 02/17 12:32
17F：→ lier1986:ng单位是没写错的 一般我看到的protocol也是用ng 02/17 12:33
18F：→ lier1986:我的经验也是 只要使用1ng的plasimd就可以长整盘的菌 02/17 12:34
19F：→ lier1986:使用电穿孔的方式是因为实验室大部分都是用这种方法 02/17 12:35
20F：→ lier1986:序列检查的部分我确实还没做 我们老板是觉得能够表现重组 02/17 12:38
21F：→ lier1986:蛋白之後再去确定序列是否正确 02/17 12:39
22F：→ lier1986:我想不通的地方是 明明plasmid是从XL1-blue里抽出的 02/17 12:41
23F：→ lier1986:但放到BL21(DE3)却没办法长 我一开始一直以为是vector 02/17 12:42
24F：→ lier1986:上的antibiotic gene坏掉 但应该不是 02/17 12:43
25F：推 bluecsky:可能你的蛋白有毒 promoter又关不紧 可以尝试在培养基中 02/18 09:06
26F：→ bluecsky:加入抑制promoter表现的东西 或是换一下培养的温度 02/18 09:07
27F：→ bluecsky:降低他的表现量或许就会长出来了 02/18 09:07