作者FireHell (冥煌 = 好硬)
看板Biotech
標題[討論] 請問做western收phospho protein的方法
時間Fri Feb 10 16:49:41 2012
我是將細胞種在10 cm dish
準備要用western看很多種phospho protein
因此特別擔心phosphatase的影響
打算使用iNtRON出的protein extraction solution
另外添加Roche出的protease inhibitor和phosphatase inhibitor
之後再以超音波破細胞儀來收protein (不使用冷熱交替法)
並且使用刮細胞的方式收細胞，不過懸浮的細胞protein我也要收起來
查到兩種常用的protocol，但是都有其缺點>"<，不知道該用哪種
Protocol A：
1.收集培養液至離心管
2.在dish中以PBS wash兩次，收集至離心管
3.離心，去除上清液
4.在dish加入200 uL protein extraction solution
5.刮下細胞，收集至同一離心管
6.超音波破細胞
缺點：細胞收不乾淨，若最後再用PBS wash並收集，
則會降低protein extraction solution濃度 (買來就是1X，不能再稀釋)
Protocol B：
1.直接在培養液中刮下細胞，收集至離心管
2.在dish中以PBS wash兩次，收集至離心管
3.離心，去除上清液
4.在離心管中以PBS wash一次
5.在離心管加入200 uL protein extraction solution
6.超音波破細胞
缺點：細胞在無phosphatase inhibitor下刮除
可能導致細胞破裂進而使protein去磷酸化
請位各位覺得哪個protocol比較好，有沒有改進辦法呢？
感謝回答 :)
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※ 編輯: FireHell 來自: 140.112.98.115 (02/10 16:53)
1F：推 tsubasawolfy:A.第四步就用trpsin後離心回溶200uL 02/10 16:59
2F：→ tsubasawolfy:B.你擔心太多了 02/10 17:01
3F：推 LIAR:刮細胞到底對細胞的破壞力有多少啊？ 02/11 19:06
4F：→ spirithorse:如果要抽膜蛋白,據說不能用刮的~ 02/11 19:45