作者FireHell (冥煌 = 好硬)
看板Biotech
标题[讨论] 请问做western收phospho protein的方法
时间Fri Feb 10 16:49:41 2012
我是将细胞种在10 cm dish
准备要用western看很多种phospho protein
因此特别担心phosphatase的影响
打算使用iNtRON出的protein extraction solution
另外添加Roche出的protease inhibitor和phosphatase inhibitor
之後再以超音波破细胞仪来收protein (不使用冷热交替法)
并且使用刮细胞的方式收细胞，不过悬浮的细胞protein我也要收起来
查到两种常用的protocol，但是都有其缺点>"<，不知道该用哪种
Protocol A：
1.收集培养液至离心管
2.在dish中以PBS wash两次，收集至离心管
3.离心，去除上清液
4.在dish加入200 uL protein extraction solution
5.刮下细胞，收集至同一离心管
6.超音波破细胞
缺点：细胞收不乾净，若最後再用PBS wash并收集，
则会降低protein extraction solution浓度 (买来就是1X，不能再稀释)
Protocol B：
1.直接在培养液中刮下细胞，收集至离心管
2.在dish中以PBS wash两次，收集至离心管
3.离心，去除上清液
4.在离心管中以PBS wash一次
5.在离心管加入200 uL protein extraction solution
6.超音波破细胞
缺点：细胞在无phosphatase inhibitor下刮除
可能导致细胞破裂进而使protein去磷酸化
请位各位觉得哪个protocol比较好，有没有改进办法呢？
感谢回答 :)
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◆ From: 140.112.98.115
※ 编辑: FireHell 来自: 140.112.98.115 (02/10 16:53)
1F：推 tsubasawolfy:A.第四步就用trpsin後离心回溶200uL 02/10 16:59
2F：→ tsubasawolfy:B.你担心太多了 02/10 17:01
3F：推 LIAR:刮细胞到底对细胞的破坏力有多少啊？ 02/11 19:06
4F：→ spirithorse:如果要抽膜蛋白,据说不能用刮的~ 02/11 19:45