作者ennnnno (伊諾)
看板Biotech
標題[求救] 又是ligation
時間Tue Feb 7 16:38:09 2012
大家好~
又是ligation的問題要麻煩大家了
這次是學妹遇到麻煩了
vector:8k多
insert:一共有四組,有兩組700多bp,一組800多bp,一個200多bp
compentent cell:DH5α (不過是自己做的)
restriction enzyme:NcoI (單點切)
vector用酵素切完後,會用CIP處理
從膠上切下來,用kit純化,回溶在水中
切的時間4hr以上或是overnight都有
insert切完之後,也是用kit純化
之後回溶在水中
切的時間同vector
之後做ligation 16度,overnihgt
V:I的比例是跑膠後,學長會給建議
所以比例都不太一定
然後transform
但是做不出來
之後再接到TA上
從TA上把insert切下來
但這裡有一個問題
TA clone的plasmid都是用傳統法抽的
濃度也都蠻濃的
之後用酵素切一切,不知道為什麼回收後的濃度都很淡
和vector進行ligation(比例一樣聽學長建議),結果一樣失敗
反覆做了幾次,都接不上去
可以請教各位版友,還有沒有什麼神技呢??
謝謝~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.249
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.116.94.249 (02/07 16:41)
1F：推 conective:1.勝任細胞測過效率嗎 差1-2個log就決定有沒有colony 02/07 17:20
2F：→ conective:2.insert回收濃度多少 有跑過電泳確認嗎 02/07 17:21
3F：→ conective:3.V：I比例多少？ 學長建議是什麼條件 02/07 17:21
1.勝任細胞效率10的六次
2.insert回收濃度都很淡,直接跑膠check,幾乎是快看不見的那種 (load1μl)
3.v:I我就不清楚了,學長是依跑膠後的亮度去看的
4F：推 leoblack:ligase是哪家的?! 02/07 17:21
ligase 是NEB的
5F：→ conective:4.作不出來是指都沒有菌落還是挑起來再抽都不是接好的 02/07 17:22
有時候都沒長,但有長的也挑不到= =
6F：→ conective:5.有作自接的control嗎？ 02/07 17:22
自接的control是沒做...
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.116.94.249 (02/07 18:16)
7F：→ lyu0001:check E.coli competency at leat 10^5/microgram plasmid 02/08 15:15
8F：→ noble019:ligation buffer確定一下ATP還有沒有效率 02/08 16:22
9F：→ noble019:重複冷凍解凍常會失效.換一罐buffer試試看 02/08 16:23
10F：→ qumai:提高DNA的濃度吧 02/08 23:49
11F：推 kingbar:建議試試看用KIT抽的plasmid做酵素剪切吧~我也曾經遇過用 02/09 02:15
12F：→ kingbar:傳統法抽的去切，雖然plasmid原始濃度比較高，但切完回收 02/09 02:18
13F：→ kingbar:效率就是比較低... 02/09 02:18
14F：推 kingbar:還有依我自己的經驗，這種有可能自接的ligation，insert比 02/09 02:30
15F：→ kingbar:例要比普通ligation要高一點，成功機會比較高。 02/09 02:33
16F：→ ennnnno:謝謝K大~ 02/10 09:46
17F：推 bluecsky:傳統法抽的plasmid其實純度比較差 不然kit怎麼賣.. 02/12 17:01