作者ennnnno (伊诺)
看板Biotech
标题[求救] 又是ligation
时间Tue Feb 7 16:38:09 2012
大家好~
又是ligation的问题要麻烦大家了
这次是学妹遇到麻烦了
vector:8k多
insert:一共有四组,有两组700多bp,一组800多bp,一个200多bp
compentent cell:DH5α (不过是自己做的)
restriction enzyme:NcoI (单点切)
vector用酵素切完後,会用CIP处理
从胶上切下来,用kit纯化,回溶在水中
切的时间4hr以上或是overnight都有
insert切完之後,也是用kit纯化
之後回溶在水中
切的时间同vector
之後做ligation 16度,overnihgt
V:I的比例是跑胶後,学长会给建议
所以比例都不太一定
然後transform
但是做不出来
之後再接到TA上
从TA上把insert切下来
但这里有一个问题
TA clone的plasmid都是用传统法抽的
浓度也都蛮浓的
之後用酵素切一切,不知道为什麽回收後的浓度都很淡
和vector进行ligation(比例一样听学长建议),结果一样失败
反覆做了几次,都接不上去
可以请教各位版友,还有没有什麽神技呢??
谢谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.249
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.116.94.249 (02/07 16:41)
1F：推 conective:1.胜任细胞测过效率吗 差1-2个log就决定有没有colony 02/07 17:20
2F：→ conective:2.insert回收浓度多少 有跑过电泳确认吗 02/07 17:21
3F：→ conective:3.V：I比例多少？ 学长建议是什麽条件 02/07 17:21
1.胜任细胞效率10的六次
2.insert回收浓度都很淡,直接跑胶check,几乎是快看不见的那种 (load1μl)
3.v:I我就不清楚了,学长是依跑胶後的亮度去看的
4F：推 leoblack:ligase是哪家的?! 02/07 17:21
ligase 是NEB的
5F：→ conective:4.作不出来是指都没有菌落还是挑起来再抽都不是接好的 02/07 17:22
有时候都没长,但有长的也挑不到= =
6F：→ conective:5.有作自接的control吗？ 02/07 17:22
自接的control是没做...
※ 编辑: ennnnno 来自: 140.116.94.249 (02/07 18:16)
7F：→ lyu0001:check E.coli competency at leat 10^5/microgram plasmid 02/08 15:15
8F：→ noble019:ligation buffer确定一下ATP还有没有效率 02/08 16:22
9F：→ noble019:重复冷冻解冻常会失效.换一罐buffer试试看 02/08 16:23
10F：→ qumai:提高DNA的浓度吧 02/08 23:49
11F：推 kingbar:建议试试看用KIT抽的plasmid做酵素剪切吧~我也曾经遇过用 02/09 02:15
12F：→ kingbar:传统法抽的去切，虽然plasmid原始浓度比较高，但切完回收 02/09 02:18
13F：→ kingbar:效率就是比较低... 02/09 02:18
14F：推 kingbar:还有依我自己的经验，这种有可能自接的ligation，insert比 02/09 02:30
15F：→ kingbar:例要比普通ligation要高一点，成功机会比较高。 02/09 02:33
16F：→ ennnnno:谢谢K大~ 02/10 09:46
17F：推 bluecsky:传统法抽的plasmid其实纯度比较差 不然kit怎麽卖.. 02/12 17:01