作者o030291469 ()
看板Biotech
標題[求救] qPCR測試結果疑惑
時間Mon Feb 6 20:40:47 2012
因為實驗需求，自己設計了一段qPCR用的新primer
由於用的是SYBR GREEN的KIT，
所以收到primer後就先測試是否為單一產物
用的機器是BIO-RAD的 CFX96，
機器有內建protocol會幫你從預設的Tm值上下抓總共8個溫度
這張圖為我跑出來的結果(A->H依序為57度->45度)：
http://img12.imageshack.us/img12/2705/qpcr.jpg
溫度較高的幾組都有兩個peak，
而隨著溫度越來越低右邊的那個peak就越來越小
到了最後那三個溫度就剩下單一peak，為單一產物
就圖來解釋變成隨著annealing溫度越低、primer專一性越高
怎麼跟我所學的PCR完全不一樣...沒道理啊！
本來以為是我把溫度順序看反了，
但仔細看了protocol真的是A為57度然後H 45度...
有沒有對qPCR熟悉的前輩能幫忙解惑一下呢？
(在跑qPCR前有用一般的PCR跑膠完確認為單一片段，也無dimer產生)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.44.200.136
1F：推 Rarelay:Ct 值呢？ 02/06 20:52
2F：→ o030291469:這是用來測primer專一性的protocol，為全部跑40 cycle 02/06 20:57
3F：→ o030291469:後再分析melt curve，所以沒有Ct值 02/06 20:58
4F：推 TAKONA:melting curve不能說明哪個peak是你要的product吧 02/06 23:53
5F：→ hal:送個定序...或是用限制酶切看看... 02/07 10:42
6F：→ sunnyhappy:你可以修改裡面設定的potocol，在annealing和extesion 02/11 10:24
7F：→ sunnyhappy:設定偵測，Tm值也可以增加，我設定從50~70，溫度太高 02/11 10:28
8F：→ sunnyhappy:primer會黏不上去，太低也會亂黏，搭配Ct值你可以找出 02/11 10:30
9F：→ sunnyhappy:適當的annealing 溫度 02/11 10:31
10F：→ sunnyhappy:出現兩個peak..再去BLAST確定這對primer有沒有可能夾 02/11 10:34
11F：→ sunnyhappy:別的產物 02/11 10:35