作者o030291469 ()
看板Biotech
标题[求救] qPCR测试结果疑惑
时间Mon Feb 6 20:40:47 2012
因为实验需求，自己设计了一段qPCR用的新primer
由於用的是SYBR GREEN的KIT，
所以收到primer後就先测试是否为单一产物
用的机器是BIO-RAD的 CFX96，
机器有内建protocol会帮你从预设的Tm值上下抓总共8个温度
这张图为我跑出来的结果(A->H依序为57度->45度)：
http://img12.imageshack.us/img12/2705/qpcr.jpg
温度较高的几组都有两个peak，
而随着温度越来越低右边的那个peak就越来越小
到了最後那三个温度就剩下单一peak，为单一产物
就图来解释变成随着annealing温度越低、primer专一性越高
怎麽跟我所学的PCR完全不一样...没道理啊！
本来以为是我把温度顺序看反了，
但仔细看了protocol真的是A为57度然後H 45度...
有没有对qPCR熟悉的前辈能帮忙解惑一下呢？
(在跑qPCR前有用一般的PCR跑胶完确认为单一片段，也无dimer产生)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 114.44.200.136
1F：推 Rarelay:Ct 值呢？ 02/06 20:52
2F：→ o030291469:这是用来测primer专一性的protocol，为全部跑40 cycle 02/06 20:57
3F：→ o030291469:後再分析melt curve，所以没有Ct值 02/06 20:58
4F：推 TAKONA:melting curve不能说明哪个peak是你要的product吧 02/06 23:53
5F：→ hal:送个定序...或是用限制酶切看看... 02/07 10:42
6F：→ sunnyhappy:你可以修改里面设定的potocol，在annealing和extesion 02/11 10:24
7F：→ sunnyhappy:设定侦测，Tm值也可以增加，我设定从50~70，温度太高 02/11 10:28
8F：→ sunnyhappy:primer会黏不上去，太低也会乱黏，搭配Ct值你可以找出 02/11 10:30
9F：→ sunnyhappy:适当的annealing 温度 02/11 10:31
10F：→ sunnyhappy:出现两个peak..再去BLAST确定这对primer有没有可能夹 02/11 10:34
11F：→ sunnyhappy:别的产物 02/11 10:35