作者lydiayeh (蚊子)
看板Biotech
標題[求救] PCR又mutant了....
時間Sat Feb 4 18:37:28 2012
最近要做重組蛋白
所以就是用自行設計的primer去夾cDNA 大量產PCR產物
然後與TA vector做ligation再送到菌裡養大量
抽plasmid後送定序
目前已經做過兩次 每一次都有出現mutant而無法繼續做下去
第一次用的是波士特的Taq組 30 cycle
第二次用的是DaKaRa DRR001A Ex Taq 25 cycle
已經改用具有Proof reading功能的Taq了還是定出四個mutant........
請問板上有沒有人可以給我點建議或是告訴我哪個好用的Taq polymerase咧?
拜託了T^T
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◆ From: 220.129.122.205
1F：推 leoblack:可以考慮加一點pfu做proof reading,就很好用了 02/04 19:20
2F：推 aceliang:太長的話還是別Taq吧 02/04 19:57
3F：推 nixo:用phsion 02/04 20:17
4F：推 nhxcyge:我現在是用fermentas的CloneJET PCR cloning kit 02/04 20:55
5F：→ nhxcyge:是用blunt end ligation，所以可用phusion等不易出錯的 02/04 20:55
6F：→ nhxcyge:enzyme. 太長的insert用taq很不保險~ 02/04 20:56
7F：→ jk15:phusion +1 02/04 21:33
8F：→ huuban:phusion +1 或至少 blend Taq 02/04 22:05
9F：→ rimeni:Sigma AccuTaq LA我做5kb PCR沒問題 02/04 23:21
10F：→ josephkokomo:你會不會是clone toxic的protein 有遇過在clone 02/05 10:44
11F：→ josephkokomo:toxic protein到非表現型E. coli 只有mutate的才有 02/05 10:45
12F：→ josephkokomo:toxin時到DH5a時 只有mutate的才會長colonies 02/05 10:47
13F：→ blence:樓上,DH5a其實不是"非表現型E. coli",它還是會表現你的蛋白 02/05 13:58
14F：推 bonbon0417:用Pfu ultra 02/05 21:09
15F：→ shenhsu:你所謂的mutate了是什麼? 跟database序列有4個不符? 02/08 09:42
16F：→ shenhsu:有時候是物種差異 如果不同template都那4個不同 就是SNP啦 02/08 09:45
17F：推 dennisyoung7:或是alternative splicing 02/10 01:20
18F：推 windyflyer:請問你的產物大小多少呢?我的經驗4.7k用phusion還ok 02/15 13:18
19F：→ windyflyer:超過的話 我推薦Roche一組expand long template PCR 02/15 13:18
20F：→ windyflyer:kit 名稱我忘了 但是它號稱可以P到20K 我自己那時候是 02/15 13:19
21F：→ windyflyer:來P6.2K的東西 定序OK送細胞測活性也OK唷 不過ROCHE那 02/15 13:19
22F：→ windyflyer:組是taq+具有proof reading的enzyme就是了 02/15 13:20