作者lydiayeh (蚊子)
看板Biotech
标题[求救] PCR又mutant了....
时间Sat Feb 4 18:37:28 2012
最近要做重组蛋白
所以就是用自行设计的primer去夹cDNA 大量产PCR产物
然後与TA vector做ligation再送到菌里养大量
抽plasmid後送定序
目前已经做过两次 每一次都有出现mutant而无法继续做下去
第一次用的是波士特的Taq组 30 cycle
第二次用的是DaKaRa DRR001A Ex Taq 25 cycle
已经改用具有Proof reading功能的Taq了还是定出四个mutant........
请问板上有没有人可以给我点建议或是告诉我哪个好用的Taq polymerase咧?
拜托了T^T
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.129.122.205
1F：推 leoblack:可以考虑加一点pfu做proof reading,就很好用了 02/04 19:20
2F：推 aceliang:太长的话还是别Taq吧 02/04 19:57
3F：推 nixo:用phsion 02/04 20:17
4F：推 nhxcyge:我现在是用fermentas的CloneJET PCR cloning kit 02/04 20:55
5F：→ nhxcyge:是用blunt end ligation，所以可用phusion等不易出错的 02/04 20:55
6F：→ nhxcyge:enzyme. 太长的insert用taq很不保险~ 02/04 20:56
7F：→ jk15:phusion +1 02/04 21:33
8F：→ huuban:phusion +1 或至少 blend Taq 02/04 22:05
9F：→ rimeni:Sigma AccuTaq LA我做5kb PCR没问题 02/04 23:21
10F：→ josephkokomo:你会不会是clone toxic的protein 有遇过在clone 02/05 10:44
11F：→ josephkokomo:toxic protein到非表现型E. coli 只有mutate的才有 02/05 10:45
12F：→ josephkokomo:toxin时到DH5a时 只有mutate的才会长colonies 02/05 10:47
13F：→ blence:楼上,DH5a其实不是"非表现型E. coli",它还是会表现你的蛋白 02/05 13:58
14F：推 bonbon0417:用Pfu ultra 02/05 21:09
15F：→ shenhsu:你所谓的mutate了是什麽? 跟database序列有4个不符? 02/08 09:42
16F：→ shenhsu:有时候是物种差异 如果不同template都那4个不同 就是SNP啦 02/08 09:45
17F：推 dennisyoung7:或是alternative splicing 02/10 01:20
18F：推 windyflyer:请问你的产物大小多少呢?我的经验4.7k用phusion还ok 02/15 13:18
19F：→ windyflyer:超过的话 我推荐Roche一组expand long template PCR 02/15 13:18
20F：→ windyflyer:kit 名称我忘了 但是它号称可以P到20K 我自己那时候是 02/15 13:19
21F：→ windyflyer:来P6.2K的东西 定序OK送细胞测活性也OK唷 不过ROCHE那 02/15 13:19
22F：→ windyflyer:组是taq+具有proof reading的enzyme就是了 02/15 13:20