各位大大您們好~ 最近接觸site-mutation的實驗 目標為一個10kb左右的plasmid 我們是採用overlapping PCR的方式來做 PCR1用 primer A+B 500bp左右 PCR2用 primer C+D 2500bp左右 (其中A和D都含有restriction site) 之後再拿上述產物經由gel elution後 作為template進行overlapping的動作 跑出來的結果在我們要的3kb左右有細細的band 可是底下1kb~0.75kb都有不等的雜band出現 亮度也比較亮~'~ 上頭還有一條條smear的現象...... 於是只好再進行gel elute的動作把3kb左右那段收集起來(有做跑膠check) 為了想得到更多3kb的產物(之後拿來切enzyme 進行置換 挑colony) 我們再拿這些elute出來的東西當template 用primerA+D去做PCR but.....跑出來的結果卻只有底下的雜band與smear產生 3kb那附近都沒東西 想請教的是><...最後這樣pcr是不是比較難做呢? 只有大量跑overlapping pcr過後 大量gel extract比較能得到產物是嘛...? 或是改用quickchang or phusion的kit直接一步作完比較方便快速呢? 感謝各位囉~ 如有需要我可以放圖上來QQ -- They say I have no emotions , but I'm excited even if they can't see it. --

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