各位大大您们好~ 最近接触site-mutation的实验 目标为一个10kb左右的plasmid 我们是采用overlapping PCR的方式来做 PCR1用 primer A+B 500bp左右 PCR2用 primer C+D 2500bp左右 (其中A和D都含有restriction site) 之後再拿上述产物经由gel elution後 作为template进行overlapping的动作 跑出来的结果在我们要的3kb左右有细细的band 可是底下1kb~0.75kb都有不等的杂band出现 亮度也比较亮~'~ 上头还有一条条smear的现象...... 於是只好再进行gel elute的动作把3kb左右那段收集起来(有做跑胶check) 为了想得到更多3kb的产物(之後拿来切enzyme 进行置换 挑colony) 我们再拿这些elute出来的东西当template 用primerA+D去做PCR but.....跑出来的结果却只有底下的杂band与smear产生 3kb那附近都没东西 想请教的是><...最後这样pcr是不是比较难做呢? 只有大量跑overlapping pcr过後 大量gel extract比较能得到产物是嘛...? 或是改用quickchang or phusion的kit直接一步作完比较方便快速呢? 感谢各位罗~ 如有需要我可以放图上来QQ -- They say I have no emotions , but I'm excited even if they can't see it. --

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