作者FireHell (冥煌 = 好硬)
看板Biotech
標題Re: [求救] MTT assay 處理組數值高於控制組
時間Thu Dec 29 21:11:44 2011
※ 引述《unwell ( )》之銘言：
: 已經爬過文了沒看過有人問
: 請教板友
: 我做的試驗是在caco-2貼附後 加入某藥品進行攻毒
: 另外添加兩個菌數的某菌
: 想看該菌可否使藥品對caco-2的傷害降低
: 結果
: control是沒加藥品也沒加菌 OD值平均視為100%
: 只加藥品組OD值是控制組的80% (嗯 還OK)
: 重點來了
: 只加低菌數某菌組OD值居然是control的200%!!
: 我想說 會不會是caco-2跟菌之間有吸附的關係 所以測MTT時也同時測到菌了
: 但在只加高菌數某菌組OD值是control的120%
: 而在藥品與菌共同treat下則都低於100%
: 嗚哇我該如何解釋
: MTT assay結果 實驗組比control還高呢?
: 甚至達到200%???
: 補充
: 1. 96-well 細胞數: 2x10^4/well 100 μl/well
: 2. 因為有菌的處理 反應時間設定只有12h
: 3. 在加入MTT之前 有用200 μl PBS wash 2次
: 4. triplicate, standard error挺小的
: 謝謝各位了~~~
: ※ 編輯: unwell 來自: 140.112.154.104 (12/29 17:17)
: 推 FireHell:加入MTT之前不可以用PBS wash，會把酵素洗掉 12/29 17:47
: → FireHell:很多人會犯這個錯誤 12/29 17:47
: → unwell:MTT是加在medium裡處理細胞反應4h 不是測那4h產的酵素? 12/29 18:25
3-4 h是MTT跟succinate dehydrogenase完全反應所需的時間，
不是為了讓細胞產生酵素的時間。
當然這段時間細胞也會產酵素，但量少。
: → unwell:如果會洗掉酵素 那吸掉medium那步時不就也吸掉酵素了??? 12/29 18:29
: → unwell:謝謝大家的回應 12/29 18:29
: 推 icome:要測的dehydrogenase在mitochondria 不會被洗掉 12/29 18:40
不多說看paper吧(可惜是殘體的)：
http://wenku.baidu.com/view/b290102fed630b1c59eeb578.html?from=related
緩慢吸掉的medium與medium對照組無顯著差異，所以不會吸掉很多酵素。
但是PBS洗一次吸光值降低80%；洗兩次降低98%。
再不相信就自己實驗看看有洗跟沒洗的差異吧，
我自己就試過了，吸光值會差非常的多！
如果吸光值太低，即使都是跟control比，data仍會有很大的系統誤差。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.218.89
1F：推 aceliang:我實在看不太懂這篇文章...就表11而言，將樣品混勻是要？ 12/29 22:09
2F：→ aceliang:既然細胞表面的SDH被洗起，那為什麼上清液組沒有formazan 12/29 22:10
3F：→ aceliang:又如果細胞表面沾滿了SDH，那MTT本身的意義勢必得打折了 12/29 22:11
4F：→ aceliang:大概是我慧根不足吧XDDD 12/29 22:12
5F：→ FireHell:跟樓上有過一樣的疑問，這篇很多地方說的不清楚 12/29 22:38
6F：→ FireHell:所以我就自己去試了，有洗兩次比都沒洗的吸光值下降了0.4 12/29 22:40
7F：→ FireHell:原因的部份我也是對作者的推論存疑 12/29 22:46
8F：→ a001ou:你提供的文獻反而表示要洗兩次 如此可有效降低培養基中 12/29 22:53
9F：→ a001ou:SDH的量 12/29 22:55
10F：→ FireHell:樓上您看的跟我看的是同一篇嗎？ orz 12/29 23:01
11F：→ a001ou:樓上要不要先瞭解MTT原理再來? MTT是測細胞"內"粒線體呼吸 12/29 23:30
12F：→ a001ou:鍊活性 今天你說wash會導致MTT結果減弱 那表示包外充滿會 12/29 23:31
13F：→ a001ou:造成MTT形成紫色結晶的物質(不論是酵素還是化學物質) 那就 12/29 23:32
14F：→ a001ou:表示若不wash 那MTT結晶幾乎都是包外物質造成的 如此將嚴重 12/29 23:33
15F：→ a001ou:影響MTT所要觀察的粒線體活性 why？因為wash不會洗到胞"內" 12/29 23:35
16F：→ a001ou:的粒線體 12/29 23:35
樓上講話很嗆喔，MTT原理我還要你教？
你有看到paper的結論5嗎？所以三位作者都不懂MTT原理呢！introduction寫假的？
你要不要先了解MTT的目的再來？主要是測prolifiration耶！
哪篇教科書限定胞內粒線體上的SDH才能是指標，其它也是細胞分泌的就不算？
可以麻煩您找給我嗎？
你可以多去打聽其它實驗室或其它學校怎麼做，加MTT前不wash的一堆好嗎？
17F：推 icome:可能是細胞凋亡釋放出來的 找不到SDH會被釋放的文獻 12/30 00:19
18F：→ blence:MTT不只用來測proliferation,NADH-NAD pool測量也能用 12/30 00:44
19F：→ soom:請板友討論時避免情緒性言詞 12/30 09:44
20F：推 unwell:謝謝原PO的回應 但是我wash了兩次 是為了把菌盡量wash乾淨 12/30 11:41
21F：推 unwell:而且即使wash了兩次最後OD值都很高 甚至扣掉blank後還 >1 12/30 11:47
22F：→ unwell:>1會不呈線性 我會再調整 不過我還是想問 有沒有可能這個菌 12/30 11:48
23F：→ unwell:會刺激粒線體裡酵素的表現 如果是 那其他做藥物處理測MTT的 12/30 11:50
24F：→ unwell:試驗不就都可能得考慮會不會刺激酵素的表現而結果誤差很大 12/30 11:51
25F：→ FireHell:回樓上原原PO，OD值高是因為您種的濃，如果真的有wash必 12/30 13:15
26F：→ FireHell:要，您又考量SDH遭受菌或藥物影響，可以考慮改用PI stain 12/30 13:16
27F：→ FireHell:作為您測存活率的方法 12/30 13:16
28F：→ FireHell:MTT assay作為viability確實有其前提，像飢餓(serum free 12/30 13:28
29F：→ FireHell:的環境下就可能會因autophagy降低SDH的量，值得注意 12/30 13:29
30F：→ FireHell:又比如說在complete medium環境下以autophagy inhibitor 12/30 15:46
31F：→ FireHell:(3-MA, CQ) treat細胞，會得到>100%的結果 12/30 15:47
32F：→ a001ou:那你要不要解釋一下你的推文 什麼叫做很多人犯的錯誤 加 12/31 00:11
33F：→ a001ou:MTT前不該wash？ 完全是誤導別人 還怪別人嗆? 12/31 00:11
34F：→ a001ou:有多少protocol跟原理說明wash不影響MTT 你卻任意引用一篇 12/31 00:12
35F：→ a001ou:說得不清不楚的文獻卻用肯定的語氣來支持這充滿問題的結果 12/31 00:13
36F：→ a001ou:你真的覺得這樣誤導別人是正確的? 12/31 00:14
37F：→ a001ou:還是說你有很好得證據支持你說wash"可以"有效抑制粒線體活 12/31 00:16
38F：→ a001ou:性 導致MTT結果失準? 毫無證據的亂說 我這態度剛好而已 12/31 00:17
結果你還是沒有提供任何的文獻、親手做任何的實驗
而以上這兩件事我都做了，我也不知道該說什麼了 =.=
39F：推 martyrtitan:樓上 原PO不就有嘗試過了? 12/31 00:59
40F：→ martyrtitan:版主都說避免情緒用詞了 這麼嗆有必要嘛 12/31 01:00
※ 編輯: FireHell 來自: 140.112.218.89 (01/01 23:54)